徐雅囡，鐘淳菲，陳燕蘭，閆培睿，黎攀，杜冰*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州 510000）；2. 芒市土壤肥料工作站（德宏 678400）

石斛是蘭科石斛屬植物的統(tǒng)稱。道家經(jīng)典著作《道藏》將其列為“中華九大仙草之首”[1]。我國有石斛屬植物74種2變種，主要分布于云貴、兩廣、海南及臺灣等地[2]。

傳統(tǒng)石斛質(zhì)量評價以感官和形態(tài)為主，即以“莖粗，質(zhì)重，嚼之粘牙，味苦，無渣”作為評價石斛品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，但這一方法并不能完全體現(xiàn)其內(nèi)在品質(zhì)的優(yōu)劣[3]。2015版《中國藥典》規(guī)定了鐵皮石斛的多糖和醇溶性浸出物含量標(biāo)準(zhǔn)，以此作為評價鐵皮石斛品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。李曉軍等[4]以多糖含量和醇溶性浸出物含量為指標(biāo)，分析了云南省不同產(chǎn)地和不同采收時間的鐵皮石斛之間的品質(zhì)差異。結(jié)果顯示，不同采收期的鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量差異顯著。宋紅坤等[5]建立了HPLC特征圖譜，初步比較了流蘇石斛等8個品種，發(fā)現(xiàn)其所含化學(xué)成分差異較大，但均含有丁香酸、柚皮素、石斛酚、毛蘭素等。隨著現(xiàn)代研究技術(shù)的快速發(fā)展，石斛化學(xué)成分[6-9]和藥理活性[10-13]的研究越來越廣泛。但是在以往的研究中，對不同石斛品種間多指標(biāo)比較的研究仍然較少，也沒有形成系統(tǒng)的石斛品種間質(zhì)量評價體系。因此，此次試驗(yàn)針對6個不同的石斛品種，測定其主要活性成分含量并分析多糖結(jié)構(gòu)，進(jìn)行差異性比較。以期為不同品種石斛的質(zhì)量評價以及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用到的6種石斛樣品分別為來自云南保山龍陵縣的S1-紫皮石斛、來自云南保山龍陵縣的S2-金釵石斛、來自云南保山龍陵縣的S3-鼓槌石斛、來自云南保山龍陵縣的S4-流蘇石斛、來自云南屏邊的S5-鐵皮石斛和來自安徽霍山縣衡山鎮(zhèn)的S6-霍山石斛。

1.2 試劑和儀器

無水葡萄糖對照品（LC，上海士鋒科技有限公司）；蘆丁對照品（LC，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司）；苯酚（AR，廣州化學(xué)試劑廠）；硫酸（AR，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；三氯甲烷（AR，廣州化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（AR，天津富宇精細(xì)化工有限公司）。

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHA-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（上海一科儀器有限公司）；UV5100紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市鴻科儀器廠）；DGG-9070B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BCD-256KF冰箱（海爾公司）；MAT 95XPThermo型質(zhì)譜儀（Thermo公司）；LC-20A液相色譜儀（日本（島津）有限公司）；RID-10A示差折光檢測器（日本（島津）有限公司）。

1.3 活性成分含量測定

1.3.1 浸出物含量測定

浸出物含量的測定參照2015版《中國藥典》[14]附錄Ⅹ A浸出物測定法中的熱浸法。

1.3.2 可溶性固形物含量測定

可溶性固形物含量的測定參考NY/T 2637—2014[15]。

1.3.3 總黃酮含量的測定

參考唐靜月等[16]的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行總黃酮含量的測定。

1.3.4 生物堿含量測定

參考王再花等[17]的方法進(jìn)行石斛生物堿的測定。

1.3.5 多糖含量測定

參照2015版《中國藥典》[14]中鐵皮石斛多糖含量的測定項(xiàng)進(jìn)行測定。

1.4 多糖結(jié)構(gòu)的測定

1.4.1 多糖分子量測定

參考秦子芳等[18]的方法，采用高效凝膠滲透色譜法測定石斛多糖分子量。取石斛多糖樣品液，冷凍干燥后用ddH2O溶解成10 mg/mL的溶液，并過0.45 μm尼龍膜，即為多糖分子量測定樣品液。用pH 7.0的20 mmol/L磷酸緩沖液溶解系列已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品（重均分子量分別為0.198，5，12，50，150，410，670，1 100和2 290 kDa），使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL。取20 μL樣品及系列標(biāo)準(zhǔn)品，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)多糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量和色譜圖的保留時間，由GPC軟件處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)樣品的保留時間，用GPC軟件計算出多糖分子的分子量。

1.4.2 單糖組分測定

參考秦子芳等[18]的方法，將石斛粗多糖樣品通過SephadexG-50葡聚糖凝膠色譜柱進(jìn)一步純化，將純化多糖水解、乙?；?，再進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS條件：SE-30彈性石英毛細(xì)管柱（15 m×0.2 mm×0.33 μm），柱溫初溫100 ℃，以10 ℃/min程序升溫至280 ℃，保持10 min。載氣He，柱前壓70 kPa，分流比10∶1，溶劑延遲2 min，進(jìn)樣量1.0 μL。EI離子源，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，電子倍增器電壓2 300 V，GC-MS接口溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z29～500。

1.4.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比測定

取不同石斛樣品多糖水解液，采用GC-MS進(jìn)行甘露糖與葡萄糖的峰面積比測定，記錄甘露糖色譜峰與葡萄糖色譜峰，并計算甘露糖的峰面積與葡萄糖峰面積的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種石斛的浸出物含量分析

浸出物含量在一定程度上可以反映藥材質(zhì)量，2015年《中華人民共和國藥典》將其作為評價石斛品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)之一。從表1可看到，來自云南保山龍陵縣的S2-金釵石斛、S3-鼓槌石斛、S4-流蘇石斛的水溶性浸出物的含量和醇溶性浸出物含量均遠(yuǎn)高于其余三種石斛樣品，約為其他三種石斛樣品浸出物含量的2倍。其中以流蘇石斛的水溶性浸出物含量（15.18%）和醇溶性浸出物含量（11.08%）最高，而鐵皮石斛的水溶性浸出物含量（6.50%）和醇溶性浸出物含量（0.90%）最低。2015版《中國藥典》規(guī)定，鐵皮石斛中醇溶性浸出物含量不得低于6.5%。故該供試品S4-鐵皮石斛不符合《中國藥典》規(guī)定。對來自同一產(chǎn)地的四個石斛品種進(jìn)行相關(guān)性分析，表3顯示，不同石斛品種間浸出物含量差異顯著。來自同一產(chǎn)地的不同品種石斛的水溶性浸出物含量從大到小排序?yàn)镾4-流蘇石斛＞S2-金釵石斛＞S3-鼓槌石斛＞S1-紫皮石斛，醇溶性浸出物含量從大到小排序?yàn)镾4-流蘇石斛＞S3-鼓槌石斛＞S2-金釵石斛＞S1-紫皮石斛。

表1 不同石斛樣品的活性成分含量表

2.2 不同品種石斛的固形物含量分析

由表2可知，S1-紫皮石斛的可溶性固形物含量最高（49.77%），S2-金釵石斛的可溶性固形物含量最低（9.24%）。二者均來源于云南保山龍陵縣，因此同一產(chǎn)地不同石斛品種間的可溶性固形物含量差異顯著，與表3的相關(guān)性分析結(jié)果一致。

表2 不同石斛樣品的活性成分含量表

2.3 不同品種石斛的總黃酮含量分析

研究表明，石斛中含有的黃酮類物質(zhì)具有良好的抗氧化[16]作用和抗腫瘤[19]作用。從表2中看出，6種石斛樣品的黃酮含量在0.05%～0.24%之間，其中S2-金釵石斛的黃酮含量（0.24%）最高，S4-流蘇石斛的黃酮含量（0.05%）最低，這兩種石斛樣品均來自云南保山龍陵縣。對于來自同一產(chǎn)地的四種不同品種石斛樣品進(jìn)行相關(guān)性分析，表3顯示，不同品種對石斛的黃酮含量具有極顯著的影響（p＜0.01）。來自云南保山龍陵縣的不同品種石斛黃酮含量從大到小排序?yàn)镾2-金釵石斛＞S1-紫皮石斛＞S3-鼓槌石斛＞S4-流蘇石斛。

2.4 不同石斛品種的生物堿含量分析

石斛中的生物堿在改善胰島素抵抗[20]、保護(hù)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[21]、保護(hù)大腦[22]等方面有明顯療效。6種不同品種石斛樣品中，S1-紫皮石斛生物堿含量最低，未檢出；S3-鼓槌石斛生物堿含量最高，為0.029%。對同一產(chǎn)地的4種石斛樣品進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地的不同品種對石斛生物堿含量有極顯著影響（p＜0.01）。6種石斛樣品的生物堿含量從大到小排序?yàn)镾3-鼓槌石斛＞S2-金釵石斛＞S5-鐵皮石斛＞S4-流蘇石斛、S6-霍山石斛＞S1-紫皮石斛。

2.5 不同石斛品種的多糖含量分析

石斛中所含有的大量多糖物質(zhì)是石斛的主要功能成分之一，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力[23]、抗衰老[24]等方面發(fā)揮著重要的作用。結(jié)果（表2）顯示，S6-霍山石斛的多糖含量最高，S5-鐵皮石斛和S1-紫皮石斛的多糖含量次之，而金釵、鼓槌、流蘇石斛的多糖含量偏低。對不同石斛品種和多糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析，表3顯示，不同石斛品種間多糖含量差異顯著。6種石斛樣品的多糖含量從大到小排序?yàn)镾6-霍山石斛＞S5-鐵皮石斛＞S1-紫皮石斛＞S3-鼓槌石斛＞S2-金釵石斛＞S4-流蘇石斛。

表3 石斛品種與活性成分含量的相關(guān)性分析

2.6 多糖結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 多糖分子量

如表4所示，S2～S4石斛樣品的多糖色譜峰保留時間均在43.581～59.830 min之間，而S1和S6的色譜峰保留時間在61～64 min之間，為溶劑峰，沒有檢測到其多糖的分子量。多糖的均一性與分子量的分布（分布系數(shù)D）相關(guān)，D值越接近1，表示相應(yīng)多糖樣品均一性越好。所以6種石斛樣品中，S2-金釵石斛和S4-流蘇石斛多糖的均一性最好。鐵皮石斛的D值達(dá)到7.92，說明其多糖是雜多糖。郝杰[25]在進(jìn)行霍山石斛不同分子量多糖的抗氧化研究時，測得霍山石斛的重均分子量為252 189，低于鐵皮石斛，高于其他品種的石斛，在此次試驗(yàn)結(jié)果范圍內(nèi)。

2.6.2 多糖的單糖組分及含量分析

如表5所示，6種石斛樣品的單糖組成相近，分別是由4種六碳糖（鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）和3種五碳糖（核糖、阿拉伯糖、木糖）組成。其中含量最高的兩種單糖均是甘露糖和葡萄糖，為石斛多糖組分中的主要單糖。張春燕等[26]研究了鐵皮石斛甘露糖的影響因素，結(jié)果顯示甘露糖在鐵皮石斛多糖中的含量與多糖含量呈正相關(guān)。表5顯示，S6-霍山石斛的甘露糖含量最高，S4-流蘇石斛的甘露糖含量最低，結(jié)合不同品種石斛的多糖含量（表3）發(fā)現(xiàn)不同品種石斛多糖的甘露糖含量與相應(yīng)的多糖含量呈正比。因此，此次試驗(yàn)結(jié)果與張春燕等[26]研究結(jié)果相一致。

表4 不同品種石斛多糖平均分子量及分布情況

表5 不同品種石斛多糖的單糖組成及含量 %

2.6.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比分析

如表6所示，不同品種石斛多糖的甘露糖和葡萄糖含量存在差異。其中S6-霍山石斛甘露糖和葡萄糖的絕對峰面積最大，達(dá)到5×107以上。《中國藥典》規(guī)定，鐵皮石斛多糖的甘露糖與葡萄糖峰面積比應(yīng)在2.4～8.0之間。表6顯示，6種石斛樣品甘露糖與葡萄糖峰面積比值均偏低，不符合藥典規(guī)定。

表6 不同石斛品種甘露糖與葡萄糖峰面積比

3 結(jié)論

對不同石斛品種之間活性成分含量和多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，可知不同石斛品種間品質(zhì)差異顯著。因石斛中活性成分復(fù)雜多樣，故不能以單個成分含量的高低來簡單判斷其品質(zhì)的好壞。通常來說，水溶性浸出物中含有的活性物質(zhì)主要是水溶性多糖，醇溶性浸出物中的活性物質(zhì)有黃酮和石斛堿等。S2-金釵石斛、S3-鼓槌石斛、S4-流蘇石斛的浸出物含量較高，但其黃酮、生物堿和多糖含量并不高，所以可以推斷浸出物中除了含有以往研究中的一些活性成分外，還有其它成分的存在。余麗麗等[27]的研究表明，水溶性浸出物中除水溶性多糖外，還含有有機(jī)酸、苷類等，與此次試驗(yàn)研究結(jié)果一致。因此浸出物含量的高低并不能絕對代表石斛品質(zhì)的優(yōu)劣。研究表明，石斛中黃酮物質(zhì)的抗氧化性較好[28]，且石斛多糖具有諸多良好的藥理學(xué)活性[23-24]。多糖結(jié)構(gòu)不同，其藥理作用也存在一定的差異。因此，多糖和黃酮含量常被用作評價石斛品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，以浸出物含量、黃酮含量和多糖為主要評價指標(biāo)，6種不同品種的石斛樣品以來自云南保山龍陵縣的S2-金釵石斛和來自安徽霍山縣衡山鎮(zhèn)的S6-霍山石斛品質(zhì)較優(yōu)。