弓志青 ，孟楠楠，王文亮 *

1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所（濟(jì)南 250100）；2. 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室（濟(jì)南 250100）；3. 農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室（濟(jì)南 250100）

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝科靈芝屬真菌，是一種食藥兩用的真菌，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[1-2]。靈芝孢子是靈芝生長成熟時從菌蓋彈射出來的淡霧狀的極其微小的孢子，具有雙壁結(jié)構(gòu)，外被堅硬的幾丁質(zhì)纖維素所包圍，人體很難充分吸收，破壁后更適合人體腸胃直接吸收。靈芝孢子粉中含有多種活性物質(zhì)，如多糖、三萜類、甾醇類等，具有調(diào)節(jié)免疫[3-4]、抑制腫瘤[5-6]、保肝解毒[7]、降三高[8-10]等功效。我國是世界上靈芝主要的生產(chǎn)國和出口國，2017年靈芝產(chǎn)量16.68萬 t，占全球產(chǎn)量的75%。山東是靈芝的四大主產(chǎn)區(qū)之一，占全國靈芝產(chǎn)量的1/4，主要集中在聊城冠縣，以代栽為主，其次為泰安靈芝，以段木栽培為主。

靈芝孢子粉多糖、破壁率、重金屬含量等直接影響其品質(zhì)。勵炯等[11]研究發(fā)現(xiàn)部分市售破壁靈芝孢子粉存在重金屬超標(biāo)、破壁率不達(dá)標(biāo)及雜質(zhì)摻混情況。張芝華[12]對靈芝孢子粉營養(yǎng)成分包括多糖、三萜、核苷、甾醇等進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)不同品種孢子粉營養(yǎng)成分具有顯著差異。

為更好地了解山東省不同栽培方式及不同破壁方式靈芝孢子粉理化特性，以我省段木及代栽破壁靈芝孢子粉的6個樣品為原料，對其理化性質(zhì)包括水分含量、粗脂肪、多糖、重金屬、掃描電鏡等進(jìn)行比較，為靈芝孢子粉生產(chǎn)和精深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝孢子粉樣品，共6個，取自山東省冠縣和濟(jì)南基地，以GL-S 1～6來表示，其中GL-S1和GL-S6為段木栽培，其余為代栽，GL-S，GL-S2和GL-S3為撞擊式破壁，其余3種為碾壓式破壁，品種為赤芝（表1）。

苯酚、濃硫酸、硝酸、無水乙醇、石油醚、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、DNS溶液等均為分析純。

表1 孢子粉原材料表

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SZF-06索氏抽提器，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；電子天平，奧豪斯儀器有限公司；5804R離心機(jī)，Eppendorf股份公司；UV-6100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；BT-9300S激光粒度分布儀，丹東百特儀器有限公司；SIGMA 300掃描電鏡，蔡司公司；iCAP Qc電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；VORTEX-6電動震蕩器，上海其林貝爾有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水分含量

參照GB 5009.3—2016干燥法進(jìn)行測定。

1.3.2 粗脂肪含量

參照GB 5009.6—2016索氏提取法進(jìn)行測定。

1.3.3 總糖

稱取樣品，各0.500 g，置于50 mL離心管中，沸水浴提取2 h，冷卻至室溫，以10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，用苯酚-硫酸法測定總糖含量。

1.3.4 還原糖

分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg·mL-1）于15 mL試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1.0 mL，分別準(zhǔn)確加入2 mL DNS試劑，沸水浴加熱2 min，流水冷卻，用水補(bǔ)足到15 mL刻度，在520 nm波長下測定吸光度。

取上述樣品上清，各2 mL，分別加入2 mL DNS試劑于25 mL具塞試管中，空白對照為2 mL蒸餾水，迅速振蕩搖勻，沸水浴5 min，冷水冷卻至室溫，定容至25 mL，靜置30 min后于520 nm檢測。

1.3.5 多糖

食用菌中粗多糖含量的測定參照于華崢等[13]的方法。分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液，置于20 mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，向試液中加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，靜置10 min，使用旋渦振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管放置于100 ℃水浴中15 min，在490 nm處測吸光度。以葡糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取樣品，各1.000 g，置于50 mL具塞試管中，用5 mL水浸潤樣品，緩慢加入20 mL無水乙醇，同時使用旋渦振蕩器振蕩，混合均勻，置超聲提取器中超聲提取30 min。提取結(jié)束后，以4 000 r·min-1離心10 min，棄去上清。不溶物用10 mL 80%的乙醇溶液洗滌、離心。用水將上述不溶物轉(zhuǎn)移50 mL具塞離心管中，加入50 mL蒸餾水，在沸水浴中提取2 h。冷卻至室溫，過濾，將上清轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，殘渣洗滌2～3次，洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容。此溶液為樣品測定液。

1.3.6 重金屬含量

參照GB 5009.268—2016。稱取0.2～1.0 g（精確至0.001 g）固體干樣于消解內(nèi)罐中，加入5 mL硝酸，放置過夜，放入恒溫干燥箱中消解，于160 ℃消解4 h，冷卻至室溫后，將消解內(nèi)罐取出，在控溫電熱板上，于100 ℃加熱30 min，用水定容至25 mL，進(jìn)行充分混合后備用，同時做空白試驗。

將待測樣液和空白試液分別注入電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀中，測定待測元素分析譜線強(qiáng)度的信號響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到消解液中待測元素的濃度。

1.3.7 粒度分布

采用激光法進(jìn)行樣品粒度分布的測定，取適量樣品置于激光粒度分析儀的樣品槽中，使樣品平鋪均勻。按下激光粒度分析儀上吸塵、送氣、進(jìn)樣鍵，激光粒度分析儀自動測量粒徑分布結(jié)果。

1.3.8 靈芝孢子粉破壁率檢測

根據(jù)GB/T 29344—2011血球計數(shù)法，觀察孢子粉顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.9 掃描電鏡

利用電子槍發(fā)射電子束，經(jīng)聚焦后在試樣表面作光柵狀掃描，通過檢測電子與試樣相互作用產(chǎn)生的信號對試樣表面的成分、形貌及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行觀察和分析。

1.3.10 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS、Excel分析方法進(jìn)行方差分析，采用鄧肯氏多重檢測確定數(shù)據(jù)間差異性，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝孢子粉含水率及粗脂肪含量

6個樣品靈芝孢子粉中含水量及粗脂肪結(jié)果見表2。靈芝孢子粉含水量在2.013%～7.922%之間，GL-S3含量最高，為7.922%，不同樣品之間含水量具有差異顯著；孢子粉中的粗脂肪含量在27.12%～34.05%之間，不同樣品間具有顯著差異，其中冠縣代栽的靈芝孢子粉GL-S2含量最高，為34.05%。根據(jù)中華人民共和國供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于“靈芝破壁孢子粉”的規(guī)定，其含水量應(yīng)低于9%，說明山東省靈芝孢子粉水分含量達(dá)標(biāo)。趙曉燕等[14]研究結(jié)果表明5個破壁靈芝孢子粉粗脂肪平均含量為33.34%，與此次試驗結(jié)果一致。據(jù)文獻(xiàn)[15-16]報道，靈芝孢子粉中脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，主要是油酸和亞油酸。

表2 靈芝孢子粉營養(yǎng)成分分析 %

2.2 樣品中總糖、多糖及還原糖含量

6個樣品靈芝破壁孢子粉中的總糖、還原糖和多糖含量見表2。孢子粉總糖含量在4.359%～5.769%之間，其中代栽的GL-S1和GL-S4總糖含量較高，還原糖含量在0.196%～0.247%之間。多糖含量在0.879%～1.182%之間，其中GL-S4多糖含量最高，為1.182%，段木栽培的兩個樣品GL-S1和GL-S6的多糖含量低于代栽的GL-S4含量，且具有顯著差異，而與其它樣品間無顯著差異，這與孢子粉的品種、加工工藝有密切相關(guān)。根據(jù)中華人民共和國供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于“靈芝破壁孢子粉”的規(guī)定，其粗多糖含量應(yīng)大于等于0.8%，說明山東省靈芝破壁孢子粉多糖含量滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

一般認(rèn)為，段木栽培靈芝多糖含量高于代栽靈芝多糖含量，這是由于段木栽培靈芝生長期比代栽靈芝生長期長。郭愛玲等[17]研究大段木靈芝、小段木靈芝及袋料靈芝的多糖含量，發(fā)現(xiàn)段木靈芝子實體中多糖含量高于代栽子實體多糖含量。

2.3 重金屬含量

靈芝對重金屬的吸附能力較強(qiáng)，另外在破壁加工過程中，也有可能被污染，因此對6個靈芝破壁孢子粉樣品中的3種重金屬含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。鎘含量在0.11～0.186 mg·kg-1之間，其中GL-S1中含量最高，為0.186 mg·kg-1；鉛含量在0.039 4～0.243 mg·kg-1之間，其中GL-S3的含量最高，為0.243 mg·kg-1；砷含量在0.055～0.12 mg·kg-1之間，其中GL-S1的含量最高，為0.12 mg·kg-1，說明山東省破壁靈芝孢子粉重金屬含量安全問題較為滿意。王偉影等[18]比較了市售20個靈芝孢子粉中As、Hg、Pb、Cr的含量，發(fā)現(xiàn)部分樣品Pb、Cr超標(biāo)。

靈芝孢子粉重金屬含量還沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，因其屬于保健食品一類，根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 16740—2014），每千克樣本中砷含量不超過1.0 mg，鉛含量不超過2.0 mg。根據(jù)食品中污染物限量的國標(biāo)（GB 2762—2012），重金屬鎘的含量參照食用菌制品，每千克含量不超過0.5 mg，可以看出6個樣品中鎘、鉛、砷含量均符合規(guī)定。其中，GL-S1的鎘和砷含量最高，GL-S3中鉛含量最高，這與它們的破壁方式有關(guān)，GL-S1、GL-S3是撞擊式破壁，孢子粉與機(jī)械直接接觸的重大撞擊力，使接觸面中重金屬溶出，導(dǎo)致孢子粉中重金屬含量增高。

2.4 粒度分布

靈芝孢子粉破壁后，破碎的孢壁與內(nèi)容物混合在一起，6個破壁靈芝孢子粉的體積平均徑D[4,3]和D50見表4。破壁靈芝孢子粉的D[4,3]在6.042～7.91 μm之間，D50在5.723～6.284 μm之間，其中GL-S3的D[4,3]和D50最大，且不同樣品之間D[4,3]和D50有顯著差異。碰撞式破壁的3個樣品GL-S1、GL-S2、GL-S3的D[4,3]和D50大于碾壓式的3個樣品GL-S4、GL-S5、GL-S6的粒徑，說明碾壓式破壁的孢子粉破碎更充分，破壁方式對孢子粉粒度影響較大。

表3 靈芝孢子粉中鎘、鉛、砷含量 mg/kg

表4 不同樣品靈芝孢子粉的粒徑

2.5 光鏡和掃描電鏡

從圖1可以看出，GL-S1、GL-S3、GL-S5、GL-S6 4個樣品在光鏡下破壁率都很高，達(dá)95%以上，破壁率均符合GB 29344—2012關(guān)于“靈芝破壁孢子粉采收和加工技術(shù)規(guī)范”中破壁率應(yīng)高于95%的規(guī)定。

圖1 靈芝孢子粉光鏡圖（400倍）

靈芝孢子粉表層質(zhì)地堅硬，是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的孢壁（圖2），未破壁赤芝孢子粉呈寬卵圓形，頂端平截，表面有一定數(shù)量的小洞和坑洼[1]，代栽靈芝孢子粉粒徑為（8.6～8.8 μm）×5.6 μm，而GL-S1和GL-S6段木栽培的孢子粉粒徑為8.8 μm×6.6 μm，細(xì)胞壁厚度為0.8～1 μm，段木栽培孢子粉與代栽孢子粉相比，長度相差不大，而寬度較寬，顆粒更加飽滿。采用不同的粉碎設(shè)備破壁后，孢子粉表層的層網(wǎng)結(jié)構(gòu)被破壞，但采用碾壓式設(shè)備粉碎的孢子粉GL-S5和GL-S6破壞程度更大，破碎率達(dá)100%，已無可見完整顆粒，而GL-S1、GL-S3采用碰撞式粉碎設(shè)備可見部分完整顆粒的輪廓，尤其是GL-S3破壁率較低，未達(dá)到GB 29344—2012中破壁率應(yīng)高于95%的規(guī)定。GL-S3體積平均粒徑最大，與掃描電鏡結(jié)果一致，也可以說明碾壓式的破碎方式破壁效果較差。

圖2 靈芝孢子粉掃描電鏡圖（3 000倍）

3 結(jié)論與討論

對山東省6個靈芝破壁孢子粉的理化性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝破壁孢子粉中水分、粗多糖、重金屬等指標(biāo)均滿足中華人民共和國供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但個別采用碾壓式破壁的孢子粉破壁率低于90%，低的破壁率影響孢子粉的營養(yǎng)吸收。近年來隨著低溫碰撞式破碎設(shè)備的出現(xiàn)，靈芝孢子粉破壁效果更好，達(dá)到100%，高的破壁率可提高孢子粉的免疫活性[19]。GB 29344—2012中規(guī)定采用血球計數(shù)法測定孢子粉破壁率，但此次試驗發(fā)現(xiàn)光鏡下觀察到的孢子粉破壁率達(dá)95%以上，但電鏡下個別樣品破壁率低于95%，因此建議找正規(guī)廠家購買孢子粉。

掃描電鏡發(fā)現(xiàn)段木栽培靈芝孢子粉比代栽孢子粉更飽滿，可能是段木栽培時間長，營養(yǎng)儲備充足，但段木栽培孢子粉多糖含量并未高于代栽孢子粉多糖，關(guān)于兩種栽培方式多糖調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等活性高低，還需要進(jìn)一步研究。另外，受段木栽培靈芝重茬、木頭資源少等因素的影響，段木栽培孢子粉產(chǎn)量低、價格高。

此次試驗還采用液相色譜檢測了孢子粉中靈芝酸a和b的含量，但并未檢測到。于華崢等[13]比較了靈芝子實體、菌絲體和孢子粉的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)未破壁的孢子粉中基本測不到靈芝三萜，與此次試驗結(jié)果一致。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)孢子粉中含有靈芝三萜[20-22]。靈芝中多糖和三萜在調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤上起共同作用，一些研究發(fā)現(xiàn)靈芝精粉比靈芝孢子粉的免疫功能強(qiáng)[23-24]，也有一些研究發(fā)現(xiàn)靈芝子實體和孢子粉熱水提取物的免疫刺激活性相當(dāng)[25-26]。

山東省代栽和段木栽培的破壁靈芝孢子粉中多糖、含水量、重金屬等含量符合中華供銷總社靈芝孢子粉理化性質(zhì)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)段木栽培比代栽孢子粉更飽滿，但個別樣品破壁率未達(dá)標(biāo)。此次試驗為靈芝孢子粉生產(chǎn)和精深加工提供依據(jù)。