李鋒，樸永革，付祺，劉友杰，李河霖，段賓賓*

1. 吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司（長春 130031）；2. 云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司（昆明 650106）

煙梗是卷煙生產(chǎn)中的重要副產(chǎn)物，是傳統(tǒng)造紙法再造煙葉的主要原料之一，其占葉重的比例25%～35%[1]。傳統(tǒng)再造煙葉涂布料中煙梗提取物（以下簡稱梗膏）用量占比約為40%～50%，對產(chǎn)品品質(zhì)有較大影響。由于煙梗中含有一些對感官品質(zhì)不利的成分，主要有木質(zhì)素、纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，煙梗水浸提后，梗膏中仍會保留這些不利成分，給產(chǎn)品帶來熱辣、點(diǎn)刺、發(fā)苦、辛辣等抽吸方面的不足，同時木質(zhì)雜氣突出。因此，研究梗膏的使用性能進(jìn)而對提升再造煙葉品質(zhì)具有極大的應(yīng)用價值[2-3]。

為提升梗膏的使用性，有不少關(guān)于酶制劑處理煙梗，從而提升煙梗纖維性能的報道[4]。而對梗膏的研究報道較少，主要集中在微生物發(fā)酵和美拉德反應(yīng)上，均能有效增加梗膏中的致香成分，提升產(chǎn)品抽吸品質(zhì)[5-6]。正交試驗廣泛應(yīng)用于卷煙行業(yè)，主要用來優(yōu)化相關(guān)工藝技術(shù)參數(shù)，是一種高效、快速研究多因素多水平的設(shè)計方法[7]。試驗選用木瓜蛋白酶和多酚氧化酶對梗膏進(jìn)行處理，以氨基酸態(tài)氮含量指標(biāo)來優(yōu)化酶處理梗膏的工藝參數(shù)，意在得出酶處理最優(yōu)工藝參數(shù)，以期改善梗膏的內(nèi)在品質(zhì)，提高梗膏利用率。其中，木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的的水解能力；多酚氧化酶是酶促棕色化反應(yīng)的介導(dǎo)物，梗膏中多酚類物質(zhì)的降解物可增加香氣量，對改善梗膏品質(zhì)有重要作用；氨基酸態(tài)氮指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，一定程度上可表征梗膏的抽吸品質(zhì)[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

葉膏、梗膏和基片（吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司）；基料（云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司）；木瓜蛋白酶和多酚氧化酶（寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司）。

DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；AL204型天平（感量0.000 1 g，Mettler-Toledo Group）；SHA-B 2002型恒溫水浴振蕩器（常州國華電器有限公司）；754型紫外可見分光光度計（上海精密化學(xué)儀器有限公司）；pH計。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

由于酶具有專一性，且對液體pH環(huán)境要求較高，而梗膏一般為pH 6.5，生產(chǎn)過程中難以使用相關(guān)化學(xué)試劑對液體pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，而木瓜蛋白酶和多酚氧化酶在梗膏自身pH環(huán)境下，可達(dá)到最優(yōu)處理，即不需要對梗膏pH環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)。

先添加木瓜蛋白酶對梗膏進(jìn)行水浴振蕩處理，得到梗膏T1，在梗膏中繼續(xù)添加多酚氧化酶進(jìn)行水浴振蕩處理，得到梗膏T2。分別檢測T1和T2梗膏中氨基酸態(tài)氮含量。（試驗不進(jìn)行滅活處理）。

1.2.2 正交試驗設(shè)計

在不考慮交互作用的情況下，依據(jù)正交試驗設(shè)計原理，分別對木瓜蛋白酶和多酚氧化酶的活力濃度、酶解時間和酶解溫度作為試驗因素，各設(shè)置3個水平，木瓜蛋白酶各因素三水平分別標(biāo)識為1、2、3，多酚氧化酶各因素三水平分別標(biāo)識為11、12、13，其他工藝參數(shù)保持不變，選用正交設(shè)計表L9(34)進(jìn)行表頭設(shè)計，以氨基酸態(tài)氮含量作為檢測指標(biāo)，優(yōu)化酶處理工藝。試驗參數(shù)設(shè)計見表1。

表1 正交試驗各因素水平表

1.2.3 化學(xué)成分測定

由云南同創(chuàng)分析檢測中心測定。

常規(guī)化學(xué)成分中的水溶性總糖、總植物堿、蛋白質(zhì)等按標(biāo)準(zhǔn)[11-13]測定；氨基酸態(tài)氮采用比色法[14]測定。

1.2.4 感官評吸

將未處理的梗膏和最優(yōu)酶處理的梗膏分別取適量，與葉膏、基料質(zhì)量比5∶4∶1，配成涂布液均勻涂布于再造煙葉基片上，控制涂布率為30%，制成樣品。將制備所得樣品在溫度22±1 ℃和相對濕度60%±2%的平衡室中平衡48 h，邀請云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司的卷煙感官評吸小組（共5人）進(jìn)行感官品質(zhì)評吸。以標(biāo)準(zhǔn)GB 5606.4—2005《卷煙第四部分：感官技術(shù)要求》為基礎(chǔ)[15]，評吸指標(biāo)包括嗅香、諧調(diào)、香氣量、香氣質(zhì)、雜氣、余味和刺激性等指標(biāo)，各指標(biāo)按評吸品質(zhì)檔次分別給予不同的分值，并計算評吸品質(zhì)總分。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2，由極差分析可知，木瓜蛋白酶處理梗膏試驗中，各因素對氨基酸態(tài)氮含量影響大小順序為RC＞RA＞RB，即酶解溫度＞木瓜蛋白酶活力濃度＞酶解時間。正交試驗結(jié)果顯示梗膏酶處理最佳條件為A2B3C2，即木瓜蛋白酶處理梗膏最優(yōu)工藝條件為：酶活力濃度3 000 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度55 ℃。

多酚氧化酶處理梗膏試驗中，各因素對氨基酸態(tài)氮含量影響大小順序為RA＞RB＞RC，即多酚氧化酶活力濃度＞酶解時間＞酶解溫度。正交試驗結(jié)果顯示梗膏酶處理最佳條件為A11B13C11，即多酚氧化酶處理梗膏最優(yōu)的工藝條件為：酶活力濃度300 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度50 ℃。

表2 正交試驗方案及極差分析

方差分析表明（表3），T1（木瓜蛋白酶）總模型p=0.025，在α=0.05水平上有顯著影響。因素A（酶活力濃度）和因素B（酶解時間）對梗膏中氨基酸態(tài)氮含量影響不顯著，因素C（酶解溫度）對梗膏中氨基酸態(tài)氮含量影響極顯著（α=0.01）。因此在木瓜蛋白酶處理梗膏中，應(yīng)嚴(yán)格控制木瓜蛋白酶處理梗膏的溫度。

T2（多酚氧化酶）總模型p=0.139，因素A（酶活力濃度）、因素B（酶解時間）和因素C（酶解溫度）均對梗膏中氨基酸態(tài)氮含量影響不顯著。

根據(jù)木瓜蛋白酶和多酚氧化酶各因素的影響結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)實際操作的便捷性及能耗要求，對兩種酶處理條件進(jìn)一步優(yōu)化。將木瓜蛋白酶的酶解時間由120 min降低為60 min，將多酚氧化酶的酶解溫度由50℃增加為55 ℃，其他最優(yōu)工藝指標(biāo)不變，即木瓜蛋白酶處理梗膏的最優(yōu)工藝條件為A2B1C2，多酚氧化酶處理梗膏的最優(yōu)工藝條件為A11B13C12。

2.2 運(yùn)行效果驗證及化學(xué)常規(guī)分析

為進(jìn)一步檢驗試驗方法的可靠性，驗證優(yōu)化酶處理梗膏的工藝條件，選取木瓜蛋白酶活力濃度3 000 U/mL，酶解時間60 min，酶解溫度55 ℃；多酚氧化酶活力濃度300 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度55℃，對煙梗進(jìn)行酶處理，重復(fù)試驗3次，實際測得氨基酸態(tài)氮含量為2.25%，驗證試驗結(jié)果與理論預(yù)測值誤差在1%以內(nèi)。因此，通過正交試驗法優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

現(xiàn)將經(jīng)過最優(yōu)工藝酶處理的梗膏樣品與葉膏、基料等配合使用，制成再造煙葉試驗樣品，與未經(jīng)處理的梗膏同樣條件下制備的再造煙葉在相關(guān)化學(xué)成分上進(jìn)行對比，結(jié)果如表4所示。

表3 方差分析檢驗結(jié)果

表4 不同處理樣品化學(xué)成分檢測結(jié)果

經(jīng)過酶處理的試驗樣水溶性總糖和總植物堿含量均有不同程度的增加，蛋白質(zhì)含量有所降低。樣品中蛋白質(zhì)含量降低可能是由于在梗膏中添加外援酶制劑，有效降解蛋白質(zhì)、多肽等大分子為小分子氨基酸態(tài)氮，在最后制備樣品時，達(dá)到降低蛋白質(zhì)的目的。施木克值一般可反映煙葉中的酸堿平衡關(guān)系，經(jīng)驗證明，施木克值在2以內(nèi)越高煙草品質(zhì)越好。因為可溶性總糖量過高煙氣產(chǎn)生的酸性過強(qiáng)，刺激越大，且含氮物質(zhì)過少，香氣往往不足。糖堿比也是衡量煙葉品質(zhì)的另一重要指標(biāo)，一般以6～10為宜[16-17]?？梢姡?jīng)過酶處理后的再造煙葉樣品品質(zhì)明顯提高。

2.3 感官評價

評吸結(jié)果表明（見表5）：經(jīng)過酶處理的試驗樣，感官抽吸品質(zhì)在香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、余味、刺激性和協(xié)調(diào)性上均有明顯改善?？梢姡８嘟?jīng)過酶處理后，制備的再造煙葉產(chǎn)品，抽吸品質(zhì)明顯提升。

表5 感官評價結(jié)果

3 結(jié)論與討論

采用木瓜蛋白酶和多酚氧化酶先后對梗膏進(jìn)行酶處理，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)采用正交試驗法優(yōu)化其工藝參數(shù)，最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶活力濃度3 000 U/mL，酶解時間60 min，酶解溫度55 ℃；多酚氧化酶活力濃度300 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度55 ℃。在此條件下，氨基酸態(tài)氮含量為2.25%。酶處理后的梗膏能明顯改善和修飾再造煙葉香氣，提高再造煙葉產(chǎn)品煙氣的甜潤感，降低雜氣和刺激性，使煙香協(xié)調(diào)。

對梗膏的研究主要有3方面：微生物發(fā)酵、酶處理以及美拉德反應(yīng)。段焰青等[18]、張勃等[19]均對煙草內(nèi)生菌進(jìn)行菌株培養(yǎng)，對梗膏進(jìn)行發(fā)酵處理，處理后的梗膏，可明顯降低刺激、增加香氣，提升產(chǎn)品品質(zhì)。駱莉等[20]采用生物酶和微生物對煙梗提取液的性質(zhì)進(jìn)行改良，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵后再進(jìn)行美拉德反應(yīng)，使梗膏中還原糖、氨基態(tài)氮和揮發(fā)物質(zhì)均有所增加，提升了產(chǎn)品品質(zhì)。試驗運(yùn)用正交試驗設(shè)計工具，對復(fù)合酶解工藝條件進(jìn)行研究，經(jīng)酶處理的梗膏，協(xié)調(diào)了自身化學(xué)成分，同時增加氨基酸態(tài)氮的含量，有效提高梗膏的抽吸品質(zhì)。可見復(fù)合酶處理梗膏提質(zhì)的方法可行，后續(xù)將深入研究酶處理對梗膏在再造煙葉中的提質(zhì)作用，提高梗膏的實際利用率。因此，試驗確立的復(fù)合酶處理梗膏最優(yōu)工藝參數(shù)，是一種可行、有效的處理方法，有利于提升梗膏抽吸品質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)化再造煙葉的內(nèi)在品質(zhì)。