隋明 *，周文 ，謝慧蓉，李俊儒，張鳳英

1. 四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院（都江堰 611830）；2. 四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院（成都 610065）

小麥?zhǔn)侵袊闹饕r(nóng)作物，資源十分豐富但利用率的程度很低，在加工面粉后殘留的小麥麩皮含有豐富的纖維素[1]和半纖維素[2]，可以利用高溫蒸煮法[3]、蒸汽爆破法[4]、超聲波輔助法[5]來生產(chǎn)和制備低聚木糖。低聚木糖糖漿的主要成分是木糖、木二糖、木三糖及少量的聚合度更高（≤8）的寡糖[6-7]，其中木二糖和木三糖是最為有效的成分[8]，含量越高，則低聚木糖產(chǎn)品的品質(zhì)越高。低聚木糖作為目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的超強(qiáng)因子，而二糖和三糖的促進(jìn)雙歧桿菌的能力最強(qiáng)[9]。關(guān)于低聚木糖的提取技術(shù)趨近成熟[10]，而木二糖的分離純化的工藝還有待進(jìn)一步研究，目前主要采用葡聚糖凝膠通過分子量的大小進(jìn)行洗脫分離[11]。樹脂分離技術(shù)作為一種綠色環(huán)保、高效的分離純化技術(shù)，近些年被廣泛應(yīng)用于中草藥[12]功能性成分、糖類[13]、蛋白[14]和核酸類[15]物質(zhì)的提取分離以及研究的開發(fā)中。試驗在比較了幾種樹脂對木二糖的靜態(tài)吸附與解吸效果并篩選最優(yōu)樹脂的基礎(chǔ)上，以木二糖的得率與純度為評價指標(biāo)，優(yōu)化最優(yōu)樹脂下不同流速、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對木二糖柱分離的梯度洗脫技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器設(shè)備

1.1.1 材料

D-（+）-木糖（色譜純，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)實際開發(fā)中心）；無水乙醇（沈陽泉瑞試劑有限公司）；P-Ca樹脂（上海樹脂廠）；ZA-Ca樹脂（浙江樹脂廠）；L-Na樹脂（美國羅門哈斯公司）；分子篩樹脂（上海樹脂廠）；低聚木糖（山東龍力有限責(zé)任公司）；木二糖（色譜純，日本三得利公司）。

1.1.2 儀器

層析柱（1 000 mm×15 mm）；恒流泵、全自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）；WZ-112型手持式折射儀（北京萬成北增精密儀器有限公司）；高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計采用低聚木糖糖漿上樣，通過靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附試驗確定吸附木二糖能力最佳的樹脂，通過單因素試驗對吸附條件進(jìn)行優(yōu)化。

試驗設(shè)計流程：低聚木糖糖漿→樹脂的靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附比較→篩選出最佳吸附木二糖的樹脂→最佳樹脂下的動態(tài)吸附與解吸比較→不同流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動態(tài)梯度洗脫比較→最優(yōu)流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動態(tài)梯度洗脫比較→木二糖層析柱分離最佳的技術(shù)參數(shù)。

1.2.2 試驗方法

1.2.2.1 樹脂預(yù)處理

原生態(tài)樹脂使用之前需要進(jìn)行預(yù)處理，因為樹脂中常常含有未聚合的單體、致孔劑、分散劑、等有機(jī)殘留物質(zhì)，為了提高樹脂的潔凈程度，需要用去離子水浸泡樹脂24～36 h，乙醇浸泡24 h，采用去離子水將樹脂洗凈，反復(fù)洗滌樹脂直到乙醇體積分?jǐn)?shù)小于1%。舊樹脂的處理順序：用4%氫氧化鈉浸泡24 h，用去離子水洗至中性，用4%的鹽酸浸泡，用去離子水水清洗至中性。

1.2.2.2 不同樹脂靜態(tài)吸附與解吸效果比較

取30 g無明顯游離水附著的樹脂置于250 mL三角瓶中，加入100 mL 5%低聚木糖糖漿，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速140 r/min的振蕩儀上振蕩，使樹脂充分吸附飽和，12 h后從三角瓶中吸取10 mL左右的液體保留以待測定，倒出三角瓶內(nèi)剩余溶液，依次加入500 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，將樹脂在轉(zhuǎn)速140 r/min的振蕩儀進(jìn)行解吸，得到解吸液。采用高效液相色譜法對糖漿原液、吸附后保留液、解吸液進(jìn)行定量定性分析，并計算靜態(tài)吸附率和解吸率。

1.2.2.3 最優(yōu)樹脂動態(tài)分離純化木二糖參數(shù)優(yōu)化

樹脂動態(tài)吸附與洗脫采用濕法裝柱，樹脂柱體積200 mL，在裝柱的時候樹脂始終保持濕潤，取保藏的濕潤樹脂（失水樹脂不能再使用），在裝柱時不能產(chǎn)生氣泡，會影響對糖漿的吸附，裝柱后用水沖洗3～5 BV（樹脂床體積），以壓緊樹脂和排除氣泡。將20 mL 50%低聚木糖糖液加入層析柱，待糖液完全進(jìn)入樹脂中并且最上層樹脂仍然保持濕潤，保持一段吸附時間，用0.5，1.0，1.5和2 BV的流速，用5%，10%，20%和30%乙醇梯度洗脫，每5 BV轉(zhuǎn)換一個梯度，檢測洗脫液中的木二糖含量，計算其得率與純度。

1.3 檢測方法

1.3.1 還原糖含量的測定

采用DNS法測定還原糖。參照GB/T 5009.7—2016[16]。

1.3.2 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸測定總糖。參照GB/T 15672—2009[17]。

1.3.3 木二糖含量的測定

參照QB/T 2984—2008[18]和GB/T 35545—2017[19]中的低聚木糖測定方法中的單組份方法，采用高效液相色譜法測定木二糖，當(dāng)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）計算木二糖含量時，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)（數(shù)值為1），木二糖的換算系數(shù)為0.93。色譜柱Sugarks-801；流動相為超純水；柱溫50 ℃；檢測器為RID-6A示差折光檢測器；分析條件：流速1 mL/min，流動相為高純水，溫度60 ℃（采用HPLC分析之前，需要將樣品中的乙醇蒸出，以保護(hù)分析柱不會中毒）。

1.3.4 計算公式

吸附率=樹脂吸附木二糖的量（mg）/原料液中木二糖含量（mg）×100% （1）

吸附率=洗脫液木二糖的量（mg）/樹脂吸附木二糖的量（mg）×100% （2）

木二糖得率=洗脫液中木二糖質(zhì)量濃度（mg/mL）× 洗脫液體積（mL）/吸附低聚木糖糖漿中木二糖含量（mg）×100% （3）

通過對低聚木糖在樹脂柱的動態(tài)吸附試驗得到的穿透曲線計算吸附量。當(dāng)吸附劑穿透后，可根據(jù)穿透時間，吸附劑的填裝量，進(jìn)樣量濃度等來計算出穿透吸附量，可利用計算機(jī)軟件Origin將穿透曲線積分求得的面積，再結(jié)合初始濃度、柱后流量及填裝的吸附劑的量計算出吸附劑的平衡吸附穿透吸附量，按式（4）計算。

式中：q為穿透吸附量，g/g；l為吸附柱后流量，g/mL；m為填裝活性炭的量，g；S1為圖1（C）中波峰的面積。

平衡吸附量按式（5）計算。

式中：q0為平衡吸附量，g/g；S3為圖1（C）中波峰積分面積；t0為吸附介質(zhì)吸附平衡的時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同型號樹脂對木二糖靜態(tài)吸附和解吸效果的比較

大孔樹脂純化和分離物質(zhì)的原理是根據(jù)原料中各個組分的極性、官能團(tuán)和分子量的不同而進(jìn)行的[5]。比較幾種不同樹脂對木二糖的吸附量和吸附率（如表1所示），通過對集中樹脂對木二糖吸附量和吸附率的比較，可以看出在相同條件下，Na+樹脂對木二糖吸附量最多，吸附率達(dá)到54.61%，其次為ZA-Ca樹脂，吸附率為47.57%。大孔系分子篩樹脂對其分離的效果不好，幾乎不能按照分子量將單組份分開，這主要可能因為糖類的分子量太小，如采用分離度更小凝膠樹脂效果都要好。采用乙醇洗脫后對木二糖洗脫量最多的仍然是Na+樹脂。因此通過靜態(tài)吸附結(jié)果表明，Na+樹脂對木二糖有較好分離純化效果，可作為木二糖動態(tài)吸附和解吸試驗的最優(yōu)樹脂。

李清祥[20]通過使用不同的陽離子樹脂對工業(yè)乙醇進(jìn)行脫水，結(jié)果表明Ca2+、Na+型兩種陽離子樹脂比工業(yè)中常用的K+型樹脂的效果更好，能夠節(jié)約生產(chǎn)成本減少經(jīng)濟(jì)成本，這可能因為K+的離子化傾向相對較弱且離子半徑要更大，造成吸附效果相比較差。對比試驗效果可以看出，使用乙醇作為洗脫劑分離不同聚合度的低聚木糖時，Na+型樹脂對于水溶性的糖分子吸附性更強(qiáng)，也與試驗結(jié)果一致。方偉明等[21]通過使用Na+樹脂吸附水中的無機(jī)鹽類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)：通過樹脂復(fù)蘇可以將樹脂的重復(fù)利用率增加，且可以解決Na+脫落的問題，減少引入外來離子到吸附液中。張軍華等[22]使用Bio-Gel P-2凝膠作為分離介質(zhì)、超純水作為洗脫液，一次性可以分離得到2～6個聚合度的低聚木糖分子，且木二糖純度達(dá)85%以上，木五糖的純度最低超過60%。

表1 不同型號樹脂對木二糖靜態(tài)吸附與解吸效果的比較

2.2 不同流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動態(tài)梯度洗脫Na+樹脂對吸附結(jié)果的影響

不同流速、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫Na+樹脂吸附的低聚木糖對分離得到的木二糖純度和得率的影響如表2所示。通過單因素試驗可知，流速1 BV/h，乙醇體積分?jǐn)?shù)10%時，洗脫液中的木二糖含量最高，純度也最高，得率也比較高，因此在此條件下進(jìn)行洗脫效果最佳。

表2 不同流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動態(tài)梯度洗脫Na+樹脂對木二糖的影響

楊偉東[23]使用Na+陽離子交換樹脂純化葡苷聚糖結(jié)果表明，洗脫效果收流速、溫度、上樣量、樹脂填料高度影響，流速很小或者很高時，會造成不同組分發(fā)生重疊；在相同直徑條件下填充樹脂越高，各組分分離的效果越好，但是隨著高度增加分離的時間會越久。劉迪等[24]通過使用大孔樹脂分離核桃青皮萘醌類成份的試驗中，發(fā)現(xiàn)影響吸附率的因素的先后順率為：上樣濃度＞進(jìn)樣液pH＞流速。試驗中低聚木糖、乙醇都是中性物質(zhì)因此可以忽略pH的影響，當(dāng)上樣濃度一致，在相同流速而洗脫劑濃度不同條件下，隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，洗脫液中木二糖的含量呈現(xiàn)逐漸增加又降低趨勢，比解吸量逐漸降低，而木二糖純度和得率沒有規(guī)律。

圖1 不同進(jìn)樣濃度對木二糖吸附的影響

使用高效液相色譜發(fā)測定對比不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液中分離出的組分，結(jié)果表明，采用10%乙醇作為流動相洗脫被Na+樹脂吸附的低聚木糖，結(jié)果如圖1（A）顯示，在乙醇洗脫收集液中木二糖含量達(dá)90%以上，但是還含有少量的木糖，對比同批進(jìn)行分析的低聚木糖圖譜可以看出保留時間同為12.7 min左右的是木二糖。在采用部分收集器收集過程中，11～18管中都存在單一組分木二糖，在14管中含量最為穩(wěn)定，組分單一甚至可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（99%）。圖1（B）是脫液進(jìn)行的色譜分析圖（與醇洗脫液非同批次測定），含有木糖、阿拉伯糖和少量葡萄糖，根據(jù)樹脂的特性推測，采用水作為流動相能夠洗脫下絕大部分的單糖成分，可采用此方法除去雜質(zhì)單糖。采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度洗脫，可將低聚糖洗脫下來，55%乙醇的洗脫液中不含有木糖等單糖，其成分主要是木二糖以上的寡糖。采用DNS測定總的水洗脫液中還原糖的量可知，單糖含量為2.15%。水洗脫液和醇洗脫液糖的總含量為9.17 g，醇洗脫液低聚木糖占總糖的75%。

將不同洗脫液（乙醇、水）的不同時間的洗脫液使用高效液相色譜法進(jìn)行分析，圖譜如圖1所示。

將試驗得到的大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)代入式（1）和（2）進(jìn)行擬合計算，在Na+型大孔樹脂吸附木二糖的層析條件下，傳質(zhì)阻力和顆粒內(nèi)擴(kuò)散傳質(zhì)阻力同時存在。穿透曲線的形狀都是很陡峭的直上直下的波峰，說明傳質(zhì)區(qū)的大小與傳質(zhì)阻力的大小、吸附劑顆粒的大小有密切關(guān)系。穿透曲線的陡峭說明吸附穿透時，木二糖充分地被樹脂所吸附，而樹脂的吸附能力充分地被利用，這樣使得床層的利用率增高；反之，如果曲線很平緩則說明穿透時還有較多的吸附劑沒有達(dá)到飽和，床層的利用率低。所以試驗條件較為成功，不會造成生產(chǎn)成本提高，能夠使設(shè)備效率增加。

進(jìn)樣量和進(jìn)樣濃度對洗脫液中的單體物質(zhì)分離有著重要影響，趙林果等[25]使用聚丙烯酰胺凝膠通過分子量大小分離純化低聚木糖的試驗中表明確定洗脫速度和進(jìn)樣量可以獲得純度較高的低聚木糖，該凝膠樹脂是通過分子量大小穿入樹脂中，因其分子量大小不同造成走的路徑長短不同而被分離出來的原理，蛋白質(zhì)等大分子量的物質(zhì)在分離時最先被洗脫出來。馬永強(qiáng)等[26]使用不同類型的大孔樹脂分離樹莓酮，結(jié)果表明上樣體積對純化的效果具有較大的影響。使用大孔樹脂分離純化一些天然產(chǎn)物或者功能性物質(zhì)時，上樣體積（或者濃度、質(zhì)量單位）對于使用相同類型的樹脂的洗脫流速、柱長都有直接的影響[24,27-28]。

表3顯示的是平行樣試驗的計算結(jié)果，床層利用率達(dá)68%左右，而試驗操作計算只有66%左右，這主要是因為在基礎(chǔ)數(shù)據(jù)上如層析介質(zhì)質(zhì)量稱量、流動相的體積收集、進(jìn)樣量的濃度配制等都有不同程度的誤差。而且擴(kuò)大規(guī)模試驗過程中需要考慮樹脂的顆粒大小、比表面積、孔分布、交聯(lián)度等，否則將不能確定層析介質(zhì)的填充量和分離度。采用試驗的吸附計算模型對基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行微分和積分計算可以簡化大量的計算工作。計算可得：吸附劑的平衡吸附穿透吸附量0.3 g/g，平衡吸附量0.18 g/g。理論的數(shù)據(jù)符合試驗測得的數(shù)據(jù)，說明采用模型進(jìn)行計算活性炭對木二糖的吸附能力是可行的。

表3 不同進(jìn)樣濃度對木二糖吸附的影響

3 結(jié)論

Na樹脂是幾種樹脂中分離純化木二糖的最佳樹脂，最佳參數(shù)：流速為0.8 BV，經(jīng)過2 BV的10%乙醇進(jìn)行梯度洗脫的木二糖、總得率和總純度分別為4.78 mg，62.8%和5.7%。