喻隨，鄧霞，陳思穎，吳鵬，占劍峰，胡婷*

黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（黃岡 438000）

佛手山藥產(chǎn)于湖北黃岡市蘄春、武穴等地，因其形狀似手掌而得名[1]。作為湖北省黃岡市的特色經(jīng)濟作物，佛手山藥被農(nóng)業(yè)部登記為“農(nóng)產(chǎn)品地理標志產(chǎn)品”[2]。它是一種藥食同源食物，具有強筋骨、健脾臟、除濕、益腎等作用。據(jù)報道，佛手山藥含有多種營養(yǎng)成分，如多糖、多酚、皂苷等，其中多糖是主要活性成分之一，研究表明佛手山藥多糖具有降血脂、抗腫瘤、增強免疫力、抗病變等活性[3-4]。因此，從佛手山藥中提取多糖具有重要的研究價值。

目前，國內(nèi)常用的提取山藥多糖的方法有水提法[5]、微波輔助法[6]、超聲波輔助法[7-8]、酶法[9]等。與水提法相比，酶法提取能使多糖迅速釋放；與超聲波和微波輔助提取法相比，酶法提取條件溫和，避免多糖因為溫度過高而導(dǎo)致的降解[10]。纖維素酶作為一種常用于植物多糖提取的酶，能夠有效地破壞山藥的細胞壁，加速其中水溶性多糖溶出的速率，可以極大縮短提取時間，提高多糖的提取率[9]。目前關(guān)于纖維素酶提取佛手山藥多糖的研究甚少，因此此次試驗采用纖維素酶從佛手山藥中提取多糖，并通過響應(yīng)面法確定最佳提取條件，以期提高佛手山藥多糖的提取率，為佛手山藥功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

佛手山藥（市售）；葡萄糖（AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（AR，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；濃硫酸（AR，中國平煤神馬集團開封東大化工有限公司）；纖維素酶（酶活力≥1 5000 U/g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機（FW-100，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；臺式高速離心機（H/T18MM，湖南赫西儀器裝備有限公司）；可見分光光度計（V-5600，上海元析儀器有限公司）；電子天平（CP413）：奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 佛手山藥多糖的提取

稱取1.00 g佛手山藥粉末于錐形瓶，加入一定量的纖維素酶，按料液比1∶20（g/mL）添加超純水，搖勻后，放入恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解結(jié)束后，放入100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至室溫，在5 000 r/min下離心10 min，上清液即為佛手山藥粗多糖溶液。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制

取9支試管并編號，依次精確吸取0.0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mL標準葡萄糖溶液于試管中，再加超純水至總體積為2.0 mL，接著加入1.0 mL 6%苯酚和5.0 mL濃硫酸，搖勻后，室溫靜置20 min，以1號試管作為空白對照，在490 nm下測定各試管的吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。經(jīng)測定，回歸曲線方程為y=0.012 7x+0.116 9，R2=0.999 6。

1.2.3 佛手山藥多糖提取率的測定

取2.0 mL佛手山藥粗多糖溶液，采用1.2.2的方法測定溶液中總糖的含量，并按式（1）計算佛手山藥多糖的提取率。

式中：X為樣品中多糖提取率，%；c為待測液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為待測液的體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 酶解時間對佛手山藥多糖提取率的影響

稱取6份佛手山藥粉末，各1.0 g，加入2%纖維素酶，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，分別設(shè)置酶解時間10，20，30，40，50和60 min，在40 ℃下進行酶解。

1.2.4.2 加酶量對佛手山藥多糖提取率的影響

稱取5份佛手山藥粉末，各1.0 g，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，分別設(shè)置加酶量1%，2%，3%，4%和5%，在40 ℃下酶解20 min。

1.2.4.3 酶解溫度對佛手山藥多糖提取率的影響

稱取5份佛手山藥粉末，各1.0 g，加入2%纖維素酶，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，分別設(shè)置酶解溫度35，40，45，50和55 ℃，酶解20 min。

1.2.5 響應(yīng)面試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以佛手山藥多糖提取率為響應(yīng)面（Y），選取酶解時間（A）、加酶量（B）及酶解溫度（C）為影響因素，運用Design-Expert 8.0.6.0軟件進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗的設(shè)計，響應(yīng)面因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對佛手山藥多糖提取率的影響

2.1.1 酶解時間對佛手山藥多糖提取率的影響

酶解時間對佛手山藥多糖提取率的影響如圖1所示。隨著酶解時間的延長，佛手山藥多糖提取率先升高后降低。當酶解時間為20 min時，多糖提取率達到最大；當酶解時間低于20 min時，多糖提取率較低；當酶解時間大于20 min時，多糖提取率逐漸減小，原因可能是隨著時間延長造成多糖結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致提取率降低[6]。由此可得最佳酶解時間為20 min。

圖1 酶解時間對佛手山藥多糖提取率的影響

2.1.2 加酶量對佛手山藥多糖提取率的影響

加酶量對佛手山藥多糖提取率的影響如圖2所示。隨著加酶量的增加，佛手山藥多糖提取率先升高后降低。當加酶量為2%時，多糖提取率達到最大；當酶解時間大于2%時，多糖提取率逐漸減小，可能的原因是在加酶量較低時酶可以和底物充分接觸，所以隨著酶的增加，提取率逐漸上升，但酶增加至一定量時，底物會被反應(yīng)完全，酶的活性被抑制，提取率反而下降[11]。由此可得最佳加酶量為2%。

圖2 加酶量對佛手山藥多糖提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對佛手山藥多糖提取率的影響

酶解溫度對佛手山藥多糖提取率的影響如圖3所示。隨著酶解溫度的升高，佛手山藥多糖提取率先升高后降低。當酶解溫度為40 ℃時，多糖提取率達到最大；當酶解溫度高于40 ℃時，多糖提取率逐漸減小，溫度過高會破壞酶的結(jié)構(gòu)，降低酶的活性，導(dǎo)致山藥多糖的提取率降低[12]。由此可得最佳酶解溫度為40 ℃。

圖3 酶解溫度對佛手山藥多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

對表2中各單因素與佛手山藥多糖提取率（Y）進行多項擬合回歸分析，得到回歸方程：Y=21.93-0.35A+2.4B-0.23C+0.83AB-0.32AC-0.5BC-5.5A2-3.32B2-3C2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：該模型p＜0.000 1，說明該模型極顯著；失擬項p=0.822 8＞0.05，不顯著，即模型與試驗值的差異較??；相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1＞0.9，說明該模型的擬合度較好，試驗誤差??；校正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.993 3，說明該模型能解釋99.33%響應(yīng)值的變化[13-14]。方差分析結(jié)果表明，影響佛手山藥多糖提取率的主次順序依次為加酶量（B）、酶解時間（A）和酶解溫度（C）。在回歸方程中，B、A2、B2和C2對Y值影響極其顯著（p＜0.000 1），A、AB和BC對Y值影響顯著（p＜0.05），C和AC對Y值影響不顯著（p＞0.05）。

表3 響應(yīng)面回歸模型結(jié)果方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析和提取工藝優(yōu)化

各因子交互作用響應(yīng)面分析表示，圖中因素的邊線越陡說明該因素對多糖提取率的影響越大[15]。等高線圖越接近橢圓，說明兩因素交互作用對佛手山藥多糖提取率的影響越大[16]。通過圖4～圖6可對提取過程中因素的相互作用及對佛手山藥多糖提取率的影響進行分析與評價，從而確定佛手山藥多糖提取的最佳條件。圖4為固定酶解溫度為0水平時，加酶量和酶解時間及二者之間的交互作用對佛手山藥多糖提取率的影響?？梢钥闯觯号c酶解時間（A）方向比較，加酶量（B）響應(yīng)面曲線較陡，說明對佛手山藥多糖提取率的影響大小為加酶量＞酶解時間。圖5為固定加酶量為0水平時，酶解時間和酶解溫度及二者之間的交互作用對佛手山藥多糖提取率的影響?？梢钥闯觯号c酶解溫度（C）方向比較，酶解時間（A）響應(yīng)面曲線較陡，說明對佛手山藥多糖提取率的影響大小為酶解時間＞酶解溫度。圖6為固定酶解時間為0水平時，加酶量和酶解溫度及二者之間的交互作用對佛手山藥多糖提取率的影響?？梢钥闯觯号c酶解溫度（C）方向比較，加酶量（B）響應(yīng)面曲線較陡，說明對佛手山藥多糖提取率的影響大小為加酶量＞酶解溫度。以上結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.3 模型驗證

利用Design-Expert 8.0.6.0軟件進行分析得到最優(yōu)的提取條件：酶解時間20.58 min、加酶量2%、酶解溫度39.67 ℃，在此條件下多糖提取率為22.39%?？紤]試驗的可操作性，在實際的試驗中調(diào)整工藝參數(shù)為酶解時間21 min、加酶量2%、酶解溫度40 ℃，在此條件下做3次平行試驗，佛手山藥多糖提取率為22.23%，此結(jié)果與預(yù)測值22.39%接近，說明此模型可靠，適用于佛手山藥多糖提取工藝的優(yōu)化。

圖4 酶解時間與加酶量對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖5 酶解時間和酶解溫度對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖6 加酶量與酶解溫度對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

通過纖維素酶酶解法提取佛手山藥多糖工藝的研究，得到了佛手山藥多糖提取的最佳提取條件，即酶解時間21 min、加酶量2%、酶解溫度40 ℃。在此條件下，佛手山藥多糖的提取率為22.23%。纖維素酶能夠有效破壞佛手山藥的細胞壁，極大縮短佛手山藥多糖溶出的時間，提高佛手山藥多糖的提取率，為佛手山藥多糖的生理活性研究提供理論依據(jù)，對佛手山藥多糖相關(guān)保健品的開發(fā)具有重要的意義。