勞敏軍，周小敏，李英，朱燕芳

浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司（舟山 316101）

鳀魚（Engraulis japonicus）是鳀屬（Engraulis）魚類的統(tǒng)稱, 主要分布于南北半球溫帶水域, 占世界水產(chǎn)品產(chǎn)量的10%～20%, 。中國(guó)鳀魚資源豐富, 蘊(yùn)藏量280萬～300萬 t, 年可捕量50萬 t以上[1-3]。鳀魚營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高, 蛋白質(zhì)含量15%～20%, 是優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的重要來源[2,4], 由于鳀魚個(gè)體較小, 出水后極易破肚, 進(jìn)而腐敗變質(zhì), 因而鳀魚的傳統(tǒng)加工方式是制作魚粉, 附加值低且對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染, 因此進(jìn)一步挖掘鳀魚蛋白中的功能多肽, 對(duì)于提高鳀魚的價(jià)值具有重要意義[5-6]。

糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的慢性全身性疾病[7-8]。有資料表明：到2030年, 全球糖尿病患者將增長(zhǎng)到4.39億[9], 糖尿病成為21世紀(jì)全世界最重要的健康問題之一。α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類以延緩腸道碳水化合物吸收而達(dá)到降低餐后血糖治療糖尿病的口服降糖藥物, 如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇, 但這類藥物會(huì)導(dǎo)致腸胃氣脹、腹瀉及腹痛等, 因此, 尋找新穎、無副作用、有效安全的α-糖苷酶抑制劑對(duì)于治療糖尿病具有重要意義[10-12]。胡曉飛等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者服用鳀魚提取物（魚醬油）后血糖有所降低, 鳀魚提取物能提高受試小鼠的糖耐受水平, 但由于魚醬油鹽度過高, 限制食用人群范圍, 因此, 以鳀魚為原料, 制備抑制α-糖苷酶活性多肽、開發(fā)降血糖類功能性食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

鳀魚原料（浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司提供，一半于-20 ℃冰柜冷凍保存，另一半將其二次細(xì)切處理以保證原料的均勻一致，分裝后置于-20 ℃冰柜冷凍保存）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（安捷倫）；H2050R-1高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀集團(tuán)）；DGG-9620AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；EMS-8B磁力攪拌器（天津市榮譽(yù)儀器有限公司）；ELX808酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器）；JA2003分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；TQ-5型臺(tái)式細(xì)切機(jī)（廣東番禺市恒聯(lián)食品機(jī)械廠）；W5-100 SP數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）；LGJ型冷凍干燥機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KDA-08A自動(dòng)凱氏定氮儀（上海昕瑞儀器儀表有限責(zé)任公司）等。

1.1.3 主要試劑

米椛（大連松井食品有限公司）；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（源葉生物）；α-葡萄糖苷酶（Sigma）；阿卡波糖（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；水解蛋白酶（alcalase 2.4 L）、風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme 1 000 L）均為食品級(jí)（丹麥諾維信公司）；0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）；0.2 mol/L Na2CO3；牛血清蛋白、RNase A、抑肽酶、維生素B12、慶大霉素（北京迪郎生化科技有限公司）；乙腈、三氟乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 鳀魚理化性質(zhì)分析

采用常壓干燥法測(cè)定鳀魚水分，參照G B/T 5009.3—2010；采用干法灰化法測(cè)定鳀魚灰分，參照GB/T 5009.4—2010；索氏提取法測(cè)定鳀魚脂肪，參照GB/T 5009.6—2003；采用凱氏定氮法測(cè)定鳀魚蛋白質(zhì)，參照GB/T 5009.5—2010。

1.2.2 鳀魚酶解工藝流程

鳀魚解凍，稱取150 g鳀魚碎肉于500 mL燒杯中，按料水比1∶1.5（g/mL）加水，攪拌均勻，根據(jù)蛋白酶的水解特點(diǎn)，選擇水解蛋白酶（內(nèi)切酶）進(jìn)行酶解，酶解條件為：pH 8，酶添加量為底物質(zhì)量的0.2%，55 ℃酶解4 h。選擇風(fēng)味蛋白酶（外切酶）進(jìn)行酶解，酶解條件為：pH 6，酶的添加量為底物質(zhì)量的0.4%。55 ℃酶解5 h后，酶解結(jié)束后將燒杯置于85℃水中滅酶處理20 min，取出冷卻至室溫，離心取上清液記錄質(zhì)量和體積，分裝于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 鳀魚發(fā)酵工藝

鳀魚解凍，稱取5 kg鳀魚于10 L發(fā)酵罐中，添加1.5%米椛、20%鹽，罐頂部用150 g食鹽進(jìn)行鹽封，發(fā)酵罐置于28 ℃恒溫室內(nèi)發(fā)酵6個(gè)月，發(fā)酵結(jié)束后過濾得到發(fā)酵液備用。

1.2.4 酶解液、發(fā)酵液氨基態(tài)氮和全氮含量測(cè)定

氨基態(tài)氮含量測(cè)定方法參照GB 5009.235—2016，采用凱氏定氮法測(cè)定鳀魚全氮含量。

1.2.5 鳀魚多肽凍干粉的制備

按照上酶解發(fā)酵條件制備鳀魚酶解液和鳀魚發(fā)酵液，經(jīng)100 D透析袋透析48 h后，進(jìn)行冷凍干燥，條件為-60 ℃、0.005 mBar、48 h。

1.2.6 酶解液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參照Rivera-Chávez[10]、Hyun[11]和Uraipong等[15]方法并略作修改。分別配制0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mmol/L PNPG（4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）溶液，0.5和1.0 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，0.2 mol/L Na2CO3溶液。反應(yīng)試劑按照表1依次添加，利用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并計(jì)算抑制率，以阿卡波糖作為陽性對(duì)照。

表1 各反應(yīng)物添加劑量和順序

1.2.7 鳀魚多肽分子量的測(cè)定[16]

色譜條件：色譜柱TsK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸30∶70∶0.1（體積比）。

樣品制備：以流動(dòng)相為溶劑配置濃度5.00 mg/mL的樣品，微孔濾膜（0.45 μm）過濾后進(jìn)樣。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將牛血清蛋白（Mr 66430）、RNase A（Mr 13700）、抑肽酶（Mr 6500）、維生素B12（Mr 1355）、慶大霉素（Mr 576）配成混標(biāo)，每種物質(zhì)含量均為5.00 mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 鳀魚理化性質(zhì)分析

由表2可知，鳀魚除水分外，蛋白質(zhì)含量最高，為18.62%，其次是脂肪和灰分，分別為8.61%和2.67%，說明鳀魚是良好的動(dòng)物性蛋白來源。

表2 鳀魚原料主要成分分析

2.2 酶解液氨基態(tài)氮和全氮含量測(cè)定

按照上述方法制備的鳀魚酶解液和發(fā)酵液按照GB 5009.235—2016氨基態(tài)氮的測(cè)定法和凱氏定氮法分別測(cè)定其氨基態(tài)和全氮含量，鳀魚酶解液和發(fā)酵液的氨基態(tài)氮分別為3.5%和10.0%，全氮含量分別為12.5%和13.5%，鳀魚發(fā)酵液水解度較高。

2.3 鳀魚活性肽對(duì)α-糖苷酶的抑制能力

由圖1可知，鳀魚酶解液和發(fā)酵液在0.25～2.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，對(duì)α-糖苷酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，鳀魚酶解液抑制率分別為17.58%，22.63%，25.54%和33.94%，鳀魚發(fā)酵液抑制率分別為13.49%，19.81%，25.52%和28.45%，阿卡波糖為藥物對(duì)照。在這一濃度范圍內(nèi)，鳀魚酶解液對(duì)α-糖苷酶抑制作用略高于鳀魚發(fā)酵液，由于酶解和發(fā)酵是2種不同處理機(jī)制，所以得到的活性肽的種類和大小存在差異，進(jìn)而說明鳀魚中存在豐富的α-糖苷酶抑制活性肽。

圖1 相對(duì)α-糖苷酶活力檢測(cè)

2.4 鳀魚活性肽的分子量分布

結(jié)果表明，鳀魚酶解液對(duì)α-糖苷酶抑制作用略高于鳀魚發(fā)酵液，因?yàn)槊附夥ㄖ苽浠钚噪目梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)高效完成，因此，選擇鳀魚酶解液進(jìn)行分析。選用牛血清蛋白、RNase A、抑肽酶、維生素B12、慶大霉素5種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)凝膠柱滲透層析原理，分子量大的物質(zhì)先被洗脫，具體分子量、分子量對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品的分子量與保留時(shí)間關(guān)系表

制作5種標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子量對(duì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)HPLC的保留時(shí)間的關(guān)系曲線，得到回歸方程為y=-2.877 7x+21.064（R2=0.999 5），其中x為分子量對(duì)數(shù)，y為保留時(shí)間（min）。

由圖2可以看出，鳀魚活性肽主要出現(xiàn)5個(gè)組分峰，洗脫時(shí)間分別為10.793，11.587，12.408，12.617和14.324 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各峰組分的分子量分別為3 708.26，164.51，1 018.49，861.65和219.86 Da，根據(jù)峰面積計(jì)算出這5個(gè)峰的含量分別為12.40%，24.49%，13.12%，17.95%和20.87%，占總量的88.83%，見表4。

圖2 鳀魚活性肽的HPLC圖譜

表4 鳀魚活性肽分子量分布情況表

3 討論

根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）調(diào)查的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，1965—2014年，全球水產(chǎn)品產(chǎn)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，食用水產(chǎn)品供應(yīng)量年均增長(zhǎng)3.2%[17]。世界水產(chǎn)品產(chǎn)量中國(guó)連續(xù)23年居于首位，水產(chǎn)養(yǎng)殖總量占全球的20%。隨著科技進(jìn)步，傳統(tǒng)的加工方式無法滿足消費(fèi)者對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)等方面的要求，研究顯示，酶技術(shù)特別是蛋白酶對(duì)改善水產(chǎn)品及其副產(chǎn)物風(fēng)味、生物特性有顯著效果[18]。伴隨現(xiàn)代文明而來的各種富貴病如高血壓、高血脂、糖尿病和癌癥等越來越引起關(guān)注，消費(fèi)觀念從吃飽吃好轉(zhuǎn)向防病治病，在這種形式下，功能性食品越來越受到青睞。

以鳀魚為研究對(duì)象，對(duì)鳀魚進(jìn)行常規(guī)成分分析，得到鳀魚蛋白質(zhì)含量為18.62%；利用酶工程技術(shù)和生物發(fā)酵工程技術(shù)對(duì)鳀魚活性肽進(jìn)行開發(fā)，鳀魚經(jīng)水解蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解，得到氨基態(tài)氮和全氮含量分別為3.5%和12.5%的酶解液，鳀魚經(jīng)1.5%米椛固態(tài)發(fā)酵6個(gè)月后，得到氨基態(tài)氮和全氮含量分別為10.0%和13.5%的酶解液，鳀魚發(fā)酵液的水解度較高，但是水解周期長(zhǎng)；經(jīng)微量板半定量法檢測(cè)鳀魚酶解液和發(fā)酵液對(duì)α-糖苷酶的抑制作用，在0.25～2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度升高，鳀魚酶解液和發(fā)酵液對(duì)α-糖苷酶抑制作用逐漸增強(qiáng)，且鳀魚酶解液活性略高于鳀魚發(fā)酵液，2 mg/mL時(shí)抑制率高達(dá)33.94%，由于酶工程和生物發(fā)酵工程是不同技術(shù)手段，其原理不同產(chǎn)物也存在差異，但鳀魚酶解液和鳀魚發(fā)酵液均含有良好的α-糖苷酶抑制作用，說明鳀魚中存在豐富活性多肽。由于酶解法較發(fā)酵法周期短，更利于產(chǎn)業(yè)化，因此選擇鳀魚發(fā)酵液進(jìn)行分析，使用HPLC對(duì)鳀魚酶解液的分子量分布進(jìn)行分析，得知酶解液中鳀魚活性肽分子量在219.86～3 708.26 Da范圍之間，分子量有12.40%分布在3 708.26 Da、24.49%分布在1 964.51 Da、13.12%分布在1 018.49 Da、17.95%分布在861.65 Da、20.87%分布在219.86 Da，分子量均在4 000 Da以下，均屬于小分子肽。綜上可知，鳀魚蛋白質(zhì)含量高，含有種類多樣的抑制α-糖苷酶的活性肽，其鳀魚酶解液制備周期短、效率高，且具有較小分子量，更易于人體吸收，具備開發(fā)降血糖保健食品的潛在優(yōu)勢(shì)，是開發(fā)降血糖功能食品的良好來源。

4 結(jié)論

試驗(yàn)以鳀魚為原料, 分別采用酶工程法和生物發(fā)酵工程法進(jìn)行處理, 制備了對(duì)α-糖苷酶具有抑制活性的鳀魚活性肽, 結(jié)果表明, 兩種制備方方法獲得的產(chǎn)物對(duì)α-糖苷酶均有較好的抑制效果, 其中酶法制備效率相對(duì)較高；對(duì)酶法制備產(chǎn)物進(jìn)行分析后可知, 酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度在0.25～2 mg/mL范圍內(nèi), 對(duì)α-糖苷酶的抑制活性隨著濃度增加而增強(qiáng), 酶解液質(zhì)量濃度在0.25,0.50, 1.00和2.00 mg/mL時(shí), 其抑制率分別為17.58%,22.63%, 25.54%和33.94%。其分子量在219.86～3 708.26 Da范圍之間, 具有分子量小、易吸收的特點(diǎn)。