萬(wàn) 榮，李明武，李光妹，朱惠瓊，馬 萌，劉 才

（昆明市第三人民醫(yī)院結(jié)核二科，云南昆明 650041）

結(jié)核病仍然是全球十大死因之一，是高于艾滋病在內(nèi)的單一傳染病中的頭號(hào)殺手。每年有數(shù)以百萬(wàn)的人口罹患結(jié)核病。2018 年，全球范圍內(nèi)估算有1 000 萬(wàn)（范圍：900～1 110 萬(wàn)）結(jié)核病新發(fā)病例，我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，2011～2018 年我國(guó)肺結(jié)核病報(bào)告發(fā)病率一直是全國(guó)甲乙類傳染病第二位，2017 年發(fā)病率達(dá)60.63/10 萬(wàn)[1]全球報(bào)告。因此早期診斷和治療結(jié)核病尤為重要。γ-干擾素釋放試驗(yàn)為一種新的免疫學(xué)檢查方法，已增加到WS288-2017《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)－肺結(jié)核診斷》[2]。T-SPOT.TB 作為γ－干擾素釋放試驗(yàn)一種，其檢測(cè)原理是以早期分泌抗原ESAT-6（作為抗原A）和培養(yǎng)濾過(guò)蛋白CFP-10（作為抗原B）為結(jié)核特異性抗原，刺激T 細(xì)胞釋放IFN-γ，通過(guò)形成的免疫斑點(diǎn)數(shù)快速診斷結(jié)核分枝桿菌的感染，其斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)反映結(jié)核病患者外周血中受結(jié)核特異抗原刺激分泌IFN-γ 的T 細(xì)胞的頻率強(qiáng)度[3]。本研究采集活動(dòng)性肺結(jié)核患者的靜脈血，采用T-SPOT.TB 檢測(cè)分析機(jī)體結(jié)核病的病情程度對(duì)結(jié)核特異性抗原應(yīng)答強(qiáng)度的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018 年6 月1 日至2018 年12 月31 日期間昆明市第三人民醫(yī)院結(jié)核二科收住院的400 例活動(dòng)性肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，所有患者均進(jìn)行了結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）。180 例病原學(xué)陽(yáng)性且T-SPOT.TB 陽(yáng)性肺結(jié)核患者173 例，其中男性104 例，平均年齡（43.8±17.5）歲，女性69 例，平均年齡（43.7±17.6）歲。220 例病原學(xué)陰性且T-SPOT.TB 陽(yáng)性肺結(jié)核患者190 例，其中男性108 例，平均（45.0±18.9）歲，女性82例，平均年齡（44.9±17.8）歲。比較病原學(xué)陽(yáng)性和陰性肺結(jié)核患者結(jié)核特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）應(yīng)答強(qiáng)度。同時(shí)將173 例病原學(xué)陽(yáng)性且T-SPOT.TB 陽(yáng)性肺結(jié)核患者進(jìn)行以下分組：按照抗酸桿菌涂片量（1 條～1+、2+、3+、4+），進(jìn)行分組比較；按照治療史，分為初治、復(fù)治肺結(jié)核；按照耐藥狀況分為非耐藥、耐藥肺結(jié)核??；比較不同分組中，結(jié)核特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）應(yīng)答強(qiáng)度。具體分組及診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)－肺結(jié)核診斷（WS 288-2017）》[2]及《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行標(biāo)準(zhǔn)－結(jié)核病分類（WS196-2017）》[4]。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB 試驗(yàn)方法 采集4 mL 外周血標(biāo)本置于肝素鋰抗凝的試管中，立即混勻，在4 h內(nèi)進(jìn)行PBMC 分離。離心管中預(yù)先加入4 mL RPMI 1640 液，將混勻的4 mL 抗凝全血加入離心管中，混勻。另一離心管中預(yù)先加入3 mL 淋巴細(xì)胞分離液，將混勻的8 mL 細(xì)胞懸液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上方，1 600 g 離心22 min，用加樣槍吸取白細(xì)胞層到15 mL 離心管中。再加入RPMI 1640 至11 mL，600 g 離心7 min，棄去上棄去上清液。加入AIMV 培養(yǎng)液至11 mL，350 g 離心7 min，棄去上清液。加入0.7 mL AIMV 液，充分搖勻使細(xì)胞懸液混勻。吸取10 μL 細(xì)胞懸液于40 μL 錐蟲(chóng)蘭染液中混勻再吸取10μL 加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。每份標(biāo)本調(diào)整至每毫升250 萬(wàn)個(gè)PBMC。取出T-SPOT.TB 試劑盒內(nèi)微孔板，根據(jù)標(biāo)本量取出板條。1 份標(biāo)本需4 個(gè)微孔板，陰性對(duì)照加AIMV，陽(yáng)對(duì)照加植物血凝素（試劑盒內(nèi)提供），另外2 個(gè)孔分別加入抗原A（ESAT-6）和抗原B（CFP-10）各50 μL，然后每孔分別加入100 μL 細(xì)懸液（即含有250 000 個(gè)PBMC 的懸液）。將微孔板放入5%CO2孵箱中孵育16～20 h，用pH6.8～7.2 的PBS液洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50 μL，2～8℃冰箱孵育1 h，再用PBS 液洗板，最后每孔加入顯色液50 μL。避光室溫靜置7 min，用蒸餾水沖洗后觀察結(jié)果。用放大鏡觀察記錄每個(gè)孔中的斑點(diǎn)。陰性斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，抗原A 和抗原B 檢測(cè)孔計(jì)數(shù)-陰性孔計(jì)數(shù)≥6判為陽(yáng)性。如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2 倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)判為陽(yáng)性。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查 抗酸桿菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏、痰G-xpert 檢測(cè)及痰基因芯片等結(jié)核相關(guān)檢查參照實(shí)驗(yàn)室流程操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原學(xué)陽(yáng)性和陰性肺結(jié)核T-SPOT.TB 結(jié)果比較

180 例病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核T-SPOT.TB 總的陽(yáng)性率96.1% （173/180），220 例病原學(xué)陰性肺結(jié)核T-SPOT.TB 總的陽(yáng)性率86.4%（190/220），兩者行χ2檢驗(yàn)比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=11.205，P=0.001＜0.05）。病原學(xué)陽(yáng)性且T-SPOT.TB 陽(yáng)性173例肺結(jié)核中，ESAT-6 陽(yáng)性率為96.0%（166/173）、CFP-10 陽(yáng)性率為93.6% （162/173），病原學(xué)陰性且T-SPOT.TB 陽(yáng)性190 例肺結(jié)核中，ESAT-6 陽(yáng)性率為84.7% （161/190）、CFP-10 陽(yáng)性率為88.9%（169/190），病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核和陰性肺結(jié)核ESAT-6 比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=12.753，P=0.000＜0.05）；病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核和陰性肺結(jié)核核CFP-10 比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=2.482，P=0.115＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 病原學(xué)陽(yáng)性和陰性肺結(jié)核T-SPOT.TB 結(jié)果比較［n（%）］Tab.1 Comparison of T-SPOT.TB results of pathogenic positive and negative tuberculosis ［n（%）］

2.2 根據(jù)抗酸桿菌涂片量比較T-SPOT.TB 反應(yīng)強(qiáng)度

常規(guī)抗酸桿菌涂片量（AFB）分為1 條～1+、2+、3+、4+，比較不同的AFB 量下抗原ESAT-6、CFP-10 反應(yīng)強(qiáng)度。AFB1 條～1+共97例患者，抗原ESAT-6 和抗原CFP-10 的M（P25，P75）分別為（19，110）、（21，111）；AFB2+共40 例患者，分別為（30，85）、（18，108）；AFB3+共21例患者，分別為（22，93）、（38，120）；AFB4+共15例患者，分別為（25，66）、（13，108）。四組進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異（P=0.795，0.595，均＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同抗酸桿菌涂片量比較抗原ESAT-6、CFP-10 反應(yīng)強(qiáng)度[n,M(P25,P75)]Tab.2 Comparing the response intensity of antigens ESAT-6 and CFP-10 in different Acid-fast bacilli smear amount [n,M(P25,P75)]

2.3 比較初治、復(fù)治肺結(jié)核T-SPOT.TB 的反應(yīng)強(qiáng)度

按照治療史，分為初治、復(fù)治肺結(jié)核。初治肺結(jié)核121 例，抗原ESAT-6 和抗原CFP-10 的M（P25，P75）分別為（30，86）、（21，116）；復(fù)治肺結(jié)核52 例，分別為（11，85）、（20，100）。兩組間進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，抗原ESAT-6 在初、復(fù)治肺結(jié)核比較中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.178，P=0.005＜0.05），抗原CFP-10 比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-0.856，P=0.392＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 初治、復(fù)治肺結(jié)核比較ESAT-6、CFP-10 反應(yīng)強(qiáng)度[n，M（P25，P75）]Tab.3 Comparing the response intensity of antigens ESAT-6 and CFP-10 in the primary treatment and retreatment of tuberculosis[n，M（P25，P75）]

2.4 比較耐藥、非耐藥肺結(jié)核T-SPOT.TB 的反應(yīng)強(qiáng)度

按照耐藥相關(guān)監(jiān)測(cè)，分為耐藥肺結(jié)核和非耐藥肺結(jié)核。耐藥肺結(jié)核病25 例，抗原ESAT-6 和抗原CFP-10 的M（P25，P75）分別為（12，110）、（16，110）；非耐藥肺結(jié)核病148 例，分別為（25，85）、（21，110）。兩組間進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，P=0.238，0.789，均＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表4。

表4 耐藥與非耐藥肺結(jié)核病比較抗原ESAT-6、CFP-10 反應(yīng)強(qiáng)度Tab.4 Comparing the response intensity of antigens ESAT-6 and CFP-10 in non-drug-resistant and drug-resistant tuberculosis

3 討論

T-SPOT.TB 檢測(cè)是采用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 和CFP-10（遺傳基因RD1 區(qū)丟失），其蛋白編碼來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌基因中的一個(gè)菌種特異性基因片段，被稱為RD1，這個(gè)基因片段在大部分枝桿菌及所有環(huán)境分枝桿菌（包括卡介苗）中不存在，因此ESAT-6 和CFP-10 作為抗原有較高敏感性和特異性[5]。本研究結(jié)果顯示病原學(xué)陽(yáng)性180 例肺結(jié)核，T-SPOT.TB 檢測(cè)的靈敏度達(dá)96.1%，220 例病原學(xué)陰性肺結(jié)核T-SPOT.TB 檢測(cè)的靈敏度達(dá)86.4%，顧國(guó)林[6]等進(jìn)行的菌陽(yáng)和菌陰肺結(jié)核患者T-SPOT.TB 檢測(cè)的靈敏度94.2%。景淑賢等[7]評(píng)價(jià)T-SPOT.TB 在活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值，T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色的靈敏度分別為94.55%、40.00%、10.91%，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

關(guān)于T-SPOT.TB 的臨床研究多在其臨床靈敏度方面的研究，但關(guān)于影響T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)反應(yīng)強(qiáng)度的臨床報(bào)告較少。羅紅衛(wèi)[8]探討年齡因素對(duì)T-SPOT.TB 檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示年齡組定義值與T-SPOT.TB 檢測(cè)結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝-0.138，P＝0.001。潘麗萍等[9]也研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB 在年輕的疑似肺結(jié)核患者中（14～59歲）有較好的臨床意義，但在老年患者中其診斷價(jià)值有相對(duì)下降。本組病例的平均年齡在43～45歲，對(duì)其診斷結(jié)果影響不大。

關(guān)于利用T-SPOT.TB 中的抗原ESAT-6、CFP-10 在不同病情狀態(tài)下的研究尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)病原學(xué)陽(yáng)性和陰性兩組肺結(jié)核患者T-SPOT.TB 陽(yáng)性率分別為96.1%，86.4%，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，特別是抗原ESAT-6 陽(yáng)性率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CFP-10 陽(yáng)性率比較無(wú)差異。徐茜[10]等研究發(fā)現(xiàn)痰菌陰性組和痰菌陽(yáng)性組T-SPOT.TB陽(yáng)性率分別為85.0%，94.1%，兩者統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)差異。病原學(xué)陽(yáng)性且T-SPOT.TB 陽(yáng)性173 例肺結(jié)核患者中，按照抗酸桿菌涂片量（1 條～1+、2+、3+、4+）進(jìn)行分組比較，四組抗原ESAT-6、CFP-10 進(jìn)行比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科同樣也發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)可反映體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷[11]。按治療史分初治、復(fù)治肺結(jié)核，兩組間ESAT-6、CFP-10 比較，其中抗原ESAT-6 在初、復(fù)治肺結(jié)核比較中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，抗原CFP-10 比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；按照耐藥狀況分非耐藥、耐藥肺結(jié)核，兩組間抗原ESAT-6、CFP-10 比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由以上結(jié)果可以看出：T-SPOT.TB 陽(yáng)性檢出率在病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核中較高，且反映其免疫強(qiáng)度抗原ESAT-6 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。周玉利[12]等也研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB陽(yáng)性標(biāo)本中，抗原ESAT-6 陽(yáng)性且CFP-10 陰性比例高于抗原ESAT-6 陰性且CFP-10 陽(yáng)性的比例。總之，結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的敏感性較好，利用其應(yīng)答強(qiáng)度反映結(jié)核感染活動(dòng)程度有一定臨床意義，特別是早期分泌蛋白抗原ESAT-6 有較大的臨床意義。

總之，結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的敏感性較好，利用其應(yīng)答強(qiáng)度反映結(jié)核感染活動(dòng)程度有一定臨床意義，特別是早期分泌蛋白抗原ESAT-6 有較大的臨床意義。