羅 丹，楊承綱

（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/ 云南省腫瘤醫(yī)院病理科，云南昆明 650118）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中膀胱尿路上皮癌占90%以上，具有復(fù)雜多變的生物學(xué)行為，突出表現(xiàn)為易復(fù)發(fā)、多發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移。目前，針對膀胱癌的主要治療手段是手術(shù)切除以及放化療，但膀胱癌的高復(fù)發(fā)率使得治療效果不理想，因此，尋找特異性分子靶向治療對提高膀胱尿路上皮癌的臨床預(yù)后具有重要意義。橋接整合因子1（bridging integrator-1，Bin1）亦稱Amphiphysin2,是一種C-myc N-末端連接蛋白，在多種腫瘤中表達(dá)異常，且Bin1 的表達(dá)異常與癌的進(jìn)展有關(guān)[1]，但在膀胱尿路上皮癌中的作用機(jī)制尚未明確。該研究旨在觀察沉默Bin1 基因?qū)Π螂啄蚵飞掀ぐ㏕24 細(xì)胞在體內(nèi)外生長的影響，初步探討B(tài)in1 在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中的基因調(diào)控作用，有助于揭示Bin1 與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

T24 細(xì)胞、shRNA 病毒、陰性對照病毒購于上海吉?jiǎng)P有限公司；CCK8 試劑盒、PI 核酸熒光染料購于Sigma 公司；凋亡試劑盒購于eBioscience 公司；裸鼠購于上海靈暢生物科技有限公司;熒光顯微鏡為日本Olympus 公司；倒置顯微鏡為上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀為Millipore 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株T24 采用10%的胎牛血清的RPMI-1640 基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃、5%CO2。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的T24 細(xì)胞，依據(jù)《慢病毒感染細(xì)胞手冊》[2]對其進(jìn)行感染。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（KD 組，轉(zhuǎn)染Bin1 基因的shRNA 病毒，能沉默Bin1 基因）和陰性對照組（NC 組，轉(zhuǎn)染陰性對照病毒），感染后第72 h 檢測感染效率并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活力檢測（CCK8 法）

將處于對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，并接種于96 孔板，再置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后24、48、72、96、120 h，加入10 μL CCK-8 試劑于孔中，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測定波長為450 nm 的光的吸光率（OD450 nm 值），然后繪制曲線。

1.4 流式細(xì)胞凋亡檢測

將兩組T24 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長至覆蓋率約為70%時(shí)，制備成細(xì)胞懸液，收集全部細(xì)胞于離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，離心棄上清后洗滌細(xì)胞沉淀，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光15 min，上機(jī)檢測。

1.5 流式細(xì)胞周期檢測法

將兩組細(xì)胞生長至覆蓋率約為80%時(shí)（細(xì)胞未進(jìn)入生長平臺期），消化收集細(xì)胞，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，離心棄上清后洗滌細(xì)胞沉淀，用75%的乙醇進(jìn)行固定，離心去固定液，再次洗滌細(xì)胞沉淀，用無RNA 酶的碘化丙啶染色液對細(xì)胞進(jìn)行染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況，繪制直方圖。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞消化制備成細(xì)胞懸液，按照800 個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 d 后，多聚甲醛固定細(xì)胞克隆，GIMSA 染色后，拍照計(jì)數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.7 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

取適應(yīng)性飼養(yǎng)4 周裸鼠20 只，均為雌性，隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組及對照組，每組10 只。取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染了Bin1 基因的shRNA 病毒與陰性對照病毒的T24 細(xì)胞懸液200 μL（含活細(xì)胞數(shù)1×107）分別注射到兩組小鼠皮下，構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型。從細(xì)胞注射開始，每天觀察裸鼠的生長狀態(tài)及成瘤情況，繪制腫瘤生長曲線，41 d 后處死兩組成瘤裸鼠，取腫瘤測量體積、稱重記錄、比較及分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料符從正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞增殖的影響

采用CCK8 法分析沉默Bin1 基因的表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響。OD450 在這里反映了具有活力的細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:相比對照組，從第1～5 天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖減緩（圖1），沉默Bin1 基因表達(dá)能夠抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖活性[NC vs KD:（1.28±0.67）vs（0.74±0.15），P＜0.001]。

圖1 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of silence of Bin1 gene on the cell proliferation in T24 cells

2.2 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比對照組，試驗(yàn)組凋亡數(shù)增多（圖2），說明沉默Bin1 基因表達(dá)可以促進(jìn)膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞凋亡[NC vs KD:（4.31±0.17）vs（6.41±0.54），P＜0.01]。

圖2 沉默Bin1 的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of silence of Bin1 gene on the cell apoptosis in T24 cells

2.3 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞周期的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)分析沉默Bin1 表達(dá)對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比對照組，實(shí)驗(yàn)組處于S 期的細(xì)胞減少（P＜0.05），處于G1、G2/M 期的細(xì)胞增多（P＜0.05，圖3），說明沉默Bin1 基因的表達(dá)對T24 細(xì)胞周期有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖3 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞周期的影響Fig.3 The effect of silence of Bin1 gene on the cell cycle progression in T24 cells

2.4 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞克隆形成的影響

克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比對照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少（P＜0.001，圖4）。結(jié)果表明，沉默Bin1 基因的表達(dá)能抑制T24 細(xì)胞克隆形成的能力。

圖4 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞克隆形成的影響Fig.4 Effect of silence of Bin1 gene on the colony formation in T24 cells

2.5 沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞裸鼠皮下成瘤性的影響

處死小鼠，觀察裸鼠成瘤情況，結(jié)果顯示：與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的裸鼠移植瘤體平均體積明顯減?。≒＜0.05，圖5），實(shí)驗(yàn)組瘤體重量減?。≒＜0.05，圖6），繪制腫瘤體積生長曲線，可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長速度減慢（P＜0.05，圖7）。這提示沉默Bin1 基因的表達(dá)能抑制膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞種植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長。

圖5 實(shí)驗(yàn)組與對照組T24 裸鼠種植瘤大小(種植瘤照片)Fig.5 Effect of silence of Bin1 gene on the colony formation in T24 cells （the photo of planted tumors）

圖6 實(shí)驗(yàn)組與對照組T24 裸鼠種植瘤重量Fig.6 The weight of planted T24 tumors in NC and KD group

圖7 腫瘤體積生長曲線Fig.7 Tumor growth curves

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常與癌基因的激活、抑癌基因的失活缺失密切相關(guān)。Bin1 因具有抑癌作用的配體蛋白而被發(fā)現(xiàn)[3]，能廣泛表達(dá)于正常細(xì)胞中，但在多種惡性腫瘤中低表達(dá)或缺失[4-7]，多個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)Bin1 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]、抑制細(xì)胞周期[9]、抑制細(xì)胞增殖[4，10]，并與腫瘤轉(zhuǎn)移[11]、腫瘤免疫逃逸與治療[12-14]、腫瘤耐藥[9，15]、DNA 修復(fù)相關(guān)[1]，具有影響癌癥的進(jìn)展及預(yù)后的作用[1]。該實(shí)驗(yàn)通過慢病毒沉默Bin1 基因的表達(dá)對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)中采用了CCK8、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、克隆形成等方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默Bin1 基因可以使膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞的增殖活性降低、凋亡增多、體外成瘤能力降低（克隆形成減少）；且通過構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型，發(fā)現(xiàn)沉默Bin1 基因的表達(dá)能使T24 細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力降低，此外，還發(fā)現(xiàn)Bin1 對T24 細(xì)胞周期具有一定的調(diào)節(jié)作用。此次試驗(yàn)證明Bin1 有促進(jìn)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的生長作用，與Bin1 抑癌的作用相互矛盾。這種矛盾的表現(xiàn)，推測具有以下可能：（1）基因在腫瘤的生長進(jìn)展中有多個(gè)腫瘤通道及多個(gè)基因調(diào)控，單個(gè)基因的沉默后可能出現(xiàn)的預(yù)期結(jié)果被其他基因的作用而掩蓋；（2）Bin1 在膀胱尿路上皮癌中可能具有一定的組織特異性。

綜上所述，沉默Bin1 基因的表達(dá)能夠明顯影響膀胱尿路上皮癌T24 細(xì)胞的增殖、凋亡、周期進(jìn)展、體內(nèi)外成瘤能力，這表明Bin1 在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株T24 中具有重要作用，它可能與膀胱尿路上皮癌的進(jìn)展相關(guān)，為進(jìn)一步深入研究膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。