韓秋菊，王晨，李薇，李曉楠

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

柚子為蕓香科植物柚的成熟果實(shí)。成熟的柚子味道酸甜、涼潤，營養(yǎng)價值和藥用價值都很高，是最具食療功效的水果之一。柚子皮可用于清熱去火，去油解膩，也可醒酒、助消化。柚子皮中的黃酮類物質(zhì)包括柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、蕓香苷等，具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓的作用，能降低血液中的膽固醇，減少血栓的形成，可用于預(yù)防和治療心腦血管類疾病[1-3]。柚子皮既厚且大，占柚子重量的20%～30%，又富含黃酮類化合物，是提取黃酮類物質(zhì)的理想原料。本研究利用雙水相萃取法從柚子皮中萃取黃酮類化合物，為更充分地開發(fā)利用柚子資源提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

柚子皮(新鮮沙田柚果皮)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸銨、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；FW100高速萬能粉碎機(jī)；AR522CN電子天平；721s可見光分光光度計；HZQ-C恒溫振蕩培養(yǎng)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 柚子皮用蒸餾水反復(fù)沖洗后，切成1～2 cm2的小塊，50 ℃干燥箱中干燥72 h，粉碎機(jī)粉碎。

1.2.2 柚子皮中黃酮類化合物的萃取 稱取適量乙醇、硫酸銨配制萃取劑，加入25 mL的比色管中，按照液料比35∶1準(zhǔn)確稱取適量的柚子皮粉末，在 40 ℃ 下振蕩萃取1.5 h。分別測定上下相液體的體積和黃酮含量，經(jīng)由公式(1)～(4)可求得雙水相的總黃酮萃取率及得率。

R=Vt/Vb

(1)

其中，R為相比；Vt和Vb為體系上、下相的體積。

K=Ct/Cb

(2)

其中，K為黃酮分配系數(shù)，Ct和Cb為上、下相的黃酮質(zhì)量濃度。

X=1/[1+1/(R×K)]×100%

(3)

其中，X為黃酮萃取率，%。

Y=Ct×Vt×n/m

(4)

其中，Y為黃酮得率，mg/g，Ct為上相黃酮濃度；Vt為上相萃取液的體積；m為柚子皮樣品質(zhì)量；n為稀釋倍數(shù)。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用50%的乙醇溶解，定容至50 mL，制備0.2 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別將0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加入25 mL比色管中，加入30%的乙醇定容至 10 mL。加入1 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min。加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min。最后加入10%的氫氧化鈉溶液10 mL，用30%的乙醇定容至25 mL，靜置15 min。510 nm處測定各組溶液吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸出線性方程y=0.553 4x-0.001 6，R2=0.999 5。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相萃取柚子皮中黃酮類化合物最佳萃取體系的確立

液料比、萃取時間、萃取溫度不變，分別考察硫酸銨和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對柚子皮中黃酮類化合物萃取效果的影響，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對柚子皮黃酮得率、 萃取率和分配系數(shù)的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate mass fraction on flavonoids yield，extraction rate and flavonoid partition coefficient

由圖1可知，柚子皮中黃酮類化合物得率在硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的時候最大。萃取率和黃酮分配系數(shù)均隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加。

由圖2可知，柚子皮中黃酮類化合物得率在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的時候最高，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，萃取率和黃酮分配系數(shù)均出現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中雙水相體系乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取35%，硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取30%。

圖2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對柚子皮黃酮得率、 萃取率和分配系數(shù)的影響Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on flavonoids yield，extraction rate and flavonoid partition coefficient

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察萃取溫度、時間、液料比對黃酮得率的影響。結(jié)果顯示，最佳萃取溫度為40 ℃，最佳萃取時間為1.5 h，最佳液料比為35∶1。

圖3 單因素實(shí)驗(yàn)考察柚子皮黃酮的萃取條件Fig.3 Study of grapefruit peel flavonoids extraction conditions by single factor experiments

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化雙水相體系的萃取條件

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以柚子皮中總黃酮得率為評價指標(biāo)，優(yōu)化萃取工藝條件。因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface experiment

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸擬合以后，響應(yīng)值與測試變量之間的關(guān)系可以用以下多元二次回歸方程來描述：

Y=44.39+5.61A+4.08B-2.99C-2.66AB+4.18AC+1.26BC-0.73A2-3.39B2-3.59C2

回歸模型方差結(jié)果分析見表3。

表3 回歸方程模型方差Table 3 Variance of regression equation model

由表3可知，模型P為0.003 3<0.01，極顯著。模型R2=0.926 5，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合情況良好。失擬項(xiàng)P值是0.245 3>0.05，不顯著，表示方程擬合不足檢驗(yàn)不顯著，變化系數(shù)值7.35%，顯示出很高的精密度等級和實(shí)驗(yàn)值很高的可靠性。實(shí)驗(yàn)考察的3個因素P值均<0.05，影響均顯著，各因素影響由強(qiáng)到弱依次為：萃取溫度>萃取時間>液料比。各個實(shí)驗(yàn)因素對其響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)中AC的影響顯著(P值是0.019 2<0.05)。

2.3.3 響應(yīng)面圖解析 等高線圖和3D響應(yīng)面圖表示各影響因素中任意一個變量取零時，其余兩個因素對黃酮得率的影響。

由圖4可知，柚子皮黃酮得率隨萃取溫度的上升呈現(xiàn)先增后降的趨勢，近50 ℃時萃取的總黃酮量最高。黃酮得率隨著萃取時間延長呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，萃取時間1.6 h時，黃酮類化合物的得率達(dá)到了最大值。黃酮得率隨液料比增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，液料比35∶1時，黃酮類化合物的得率達(dá)到最大值。交互項(xiàng)AC的響應(yīng)面圖走勢較陡，影響顯著，與P值分析結(jié)果一致。

圖4 萃取溫度(A)、萃取時間(B)和液料比(C)對黃酮得率影響的等高線和3D響應(yīng)面圖Fig.4 Contour map and 3D response surface graph showing the effects of extraction temperature(A)，extraction time (B) and liquid-solid ration (C) on the yield of flavonoids

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由響應(yīng)面分析軟件預(yù)測，柚子皮黃酮的最佳萃取條件為：萃取溫度50.00 ℃，萃取時間1.62 h，液料比36.05∶1。模型預(yù)測柚子皮黃酮得率49.57 mg/g。為實(shí)際操作的可行性，最佳條件優(yōu)化為：萃取溫度 50 ℃，萃取時間1.6 h，液料比36∶1，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到柚子皮黃酮的實(shí)際黃酮得率為(48.22±3.04)mg/g。

3 結(jié)論

采用雙水相法萃取柚子皮中黃酮的最佳條件為：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%，萃取溫度為50 ℃，萃取時間為1.6 h，液料比為36∶1。該條件下，黃酮類化合物的得率為(48.22±3.04)mg/g。