李 盼， 霍新慧， 毛麗旦·阿扎提， 昂沙爾·畢哈孜， 丁 霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院針灸基礎(chǔ)教研室， 烏魯木齊 830011)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，由于患者?huì)存在一定程度的關(guān)節(jié)功能障礙而嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量[1]。目前該病的病因和發(fā)病機(jī)制還未完全明確[2]，因此臨床治療仍然棘手，中醫(yī)藥在RA的治療領(lǐng)域中因其癥狀改善明顯而獨(dú)具特色[3]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，新疆刺山柑和祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)灸法對(duì)AA(adjuvant arthritis，佐劑性關(guān)節(jié)炎)模型大鼠有消炎止痛的作用[4]，本研究進(jìn)一步從免疫調(diào)節(jié)角度，觀察兩種傳統(tǒng)療法對(duì)滑膜組織HSP70 (heatshockprotein70, 熱休克蛋白70)和PPARγ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ，過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ)表達(dá)的影響，為其科學(xué)應(yīng)用提供有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量約(180±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(新)2016-0002，二級(jí)潔凈動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲食和攝水。

1.1.2 藥物與試劑完全弗氏佐劑(購(gòu)自Sigma公司)，特制香煙型純艾條(南陽(yáng)臥龍漢醫(yī)艾絨廠，規(guī)格4 mm×120 mm)，懸灸支架(知福堂，蘄春上工記艾灸器具開(kāi)發(fā)有限公司)，刺山柑果風(fēng)濕止痛貼(批號(hào)20161022，由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室提供)，傷濕止痛膏(國(guó)藥準(zhǔn)字Z42020233，批號(hào)20130902，黃石市力康藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。大鼠的ELISA檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自美國(guó)Bim公司)，HSP70抗體、PPARγ抗體和內(nèi)參均購(gòu)于英國(guó)ABCAM公司，批號(hào)分別是219228-27、GR3225403-5、GR3249122-1。

1.1.3 儀器與設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司；微型離心機(jī)：北京市六一儀器廠，型號(hào)WD-2105A；通用型電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)Serial No.042BR11250；電泳槽：美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)Mini PROTEAN Tetra Cell；超靈敏全自動(dòng)成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Proteinsimple公司，型號(hào)FluorChem E。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 隨機(jī)(采用數(shù)字表法)選取10只大鼠作為正常組，進(jìn)行AA大鼠造模(參照文獻(xiàn)[5])：大鼠足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(0.1 mL/只)3 d后進(jìn)行造模成功評(píng)定，依據(jù)AI(arthritis index，關(guān)節(jié)炎指數(shù))評(píng)分[6]評(píng)定：無(wú)關(guān)節(jié)紅腫計(jì)0分；足趾關(guān)節(jié)紅腫計(jì)1分；趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹計(jì)2分；踝關(guān)節(jié)以下紅腫計(jì)3分；全部足爪(包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi))腫脹計(jì)4分。AI值即每只大鼠四肢評(píng)分分?jǐn)?shù)之和。評(píng)分達(dá)到6分以上即為造模成功。

1.2.2 分組與干預(yù) 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥組、刺山柑組、艾灸組，每組10只。陽(yáng)性藥組和刺山柑組參照文獻(xiàn)[7]分別予以傷濕止痛膏組(15 cm2/kg·d)和刺山柑果風(fēng)濕止痛貼(30 cm2/kg·d)左后足跖經(jīng)皮給藥，模型組以同樣方式予以空白凝膠膏劑。艾灸組選取腎俞、后三里穴(左右側(cè)腧穴交替進(jìn)行)，腎俞位于第2腰椎棘突下，左右側(cè)旁開(kāi)約7 mm處；后三里是膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下5 mm。采用改良的溫和懸灸方法[8]：用懸灸支架固定特制艾條，艾條點(diǎn)燃部位距穴區(qū)2 cm處施灸，每穴20 min，2個(gè)腧穴同時(shí)進(jìn)行灸治，每日1次(上午9:00開(kāi)始)。以上治療均連續(xù)治療6 d為1療程，共治療3個(gè)療程，療程間休1天。

1.2.3 AI指數(shù)、足爪容積測(cè)定 AI指數(shù)評(píng)分方法同前。采用之前方法[4]進(jìn)行的足爪容積測(cè)定，即盡量將大鼠足跖垂直放入水中至標(biāo)記線后取出，再用5ml注射器加水至原有水面高度，記錄注射器的剩余水量，其差值即為大鼠的足爪容積。

1.2.4 血清 TNF-α、IL-1β水平的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清 TNF-α、IL-1β水平。具體步驟依照試劑盒操作。

1.2.5 滑膜組織HSP70、PPARγ蛋白表達(dá)測(cè)定 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL/100 g)后，完整剝離髕骨下滑膜組織，立即放置液氮中冷凍，并轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.1 g大鼠滑膜組織充分研磨(加入鋼珠)后1 mL RIPA裂解液勻漿，17 000 rpm，4℃，10 min 取上清液按照BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，大鼠一抗HSP70、PPARγ(均為1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)過(guò)PBS洗膜15 min 3次后，加入顯色劑顯色，曝光，沖洗，采用Gel Doc XR軟件，計(jì)算目的蛋白與階Actin吸光度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)AA大鼠AI指數(shù)和足爪容積的影響與正常組比較，大鼠在造模后的AI指數(shù)和足爪容積明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，治療后各組AI指數(shù)和足爪容積明顯降低(P<0.05或0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠AI指數(shù)和足爪容積比較

2.2 對(duì)AA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響與正常組比較，模型組AA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，刺山柑組和艾灸組IL-1β水平也明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-1β的比較(pg/mL， ±s)

2.3 對(duì)AA大鼠滑膜組織HSP70、PPARγ蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織HSP70、PPARγ蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05、0.01)，刺山柑組和艾灸組HSP70蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05、0.01)，各組的PPARγ蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組HSP70蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，艾灸組HSP70蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，刺山柑組PPARγ蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與刺山柑組比較，艾灸組的HSP70蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，PPARγ蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組大鼠滑膜組織HSP70、PPARγ蛋白表達(dá)的比較(GAPDH， ±s)

a: HSP70電泳條帶b: PPARγ電泳條帶

c: HSP70蛋白表達(dá)

d: PPARγ蛋白表達(dá)

3 討論

目前臨床對(duì)RA的治療有多種藥物和手段，西醫(yī)以藥物治療為主，但因藥物的耐受性和伴隨副作用而不夠理想，中藥具有療效肯定，毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)[3]而成為研究熱點(diǎn)。刺山柑(又名野西瓜、槌果藤等)，在我國(guó)主要分布在西部的新疆等地，具有祛風(fēng)、散寒、除濕等作用[9]，在治療RA方面療效肯定且起效迅速[10]，可能的作用機(jī)制是鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制 、抑制軟骨和骨破壞等作用[11]。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”，病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，本虛是指肝腎虧虛，氣血不足，標(biāo)實(shí)即風(fēng)、寒、濕、熱邪痹阻經(jīng)脈。作為中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)外治療法，艾灸以“溫?zé)岽碳ぁ睘橹饕饔眯问?，在治療RA方面取得了顯著的臨床效果，有良好的抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛作用[12]，能夠增強(qiáng)和改善機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)炎癥損傷的修復(fù)[13]和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

腎俞是人體“先天之本”腎氣輸注于背腰部的腧穴，具有補(bǔ)腎培本、補(bǔ)益先天的功效。足三里屬于局部取穴，可起到通絡(luò)止痛的近治作用，又因是人體“先天之本”胃的合穴、胃下合穴，也具有扶助正氣、補(bǔ)益氣血的全身作用。溫和灸二穴，遠(yuǎn)近同治、標(biāo)本兼顧，共奏扶陽(yáng)補(bǔ)益之效。

TNF-α和IL-1β都是典型的炎性細(xì)胞因子，在RA的發(fā)病中起著“中心罪犯”作用[14]。熱休克蛋白是RA在關(guān)節(jié)的炎癥病變中，釋放出促關(guān)節(jié)破壞及病理進(jìn)程的內(nèi)源性生物因子之一，是機(jī)體細(xì)胞在熱休克或如病毒、缺氧等其他外來(lái)刺激情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生的[15]，HSP70被認(rèn)為是最保守、最主要的一組HSPs,也是與炎癥作用相關(guān)的重要細(xì)胞內(nèi)蛋白[16]，在RA發(fā)生、發(fā)展中既可以啟動(dòng)免疫調(diào)節(jié)通道以抑制免疫反應(yīng)[17]，又可以通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用[19]。PPAR是一類由配體激動(dòng)的核轉(zhuǎn)錄因子[18]，PPARγ是PPARs重要的亞型之一，研究顯示，PPARγ是反映RA疾病活動(dòng)度的一個(gè)有效指標(biāo)[19]，在RA的發(fā)生及發(fā)展中，可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，具有較強(qiáng)的抗炎作用[20]。

本研究表明同樣是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的外治方法，刺山柑和艾灸療法都能有效的緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足部炎癥和腫脹度，下調(diào)抗炎因子TNF-α、IL-1β水平。刺山柑可能的作用機(jī)制是上調(diào)抗炎蛋白PPARγ的表達(dá)，而艾灸是激活胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白HSP70的表達(dá)，從而最終都達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能而發(fā)揮抗炎的效應(yīng)。