郭小蛟，唐玉明，2，任道群，2，田新惠，2，劉成元，2，張星宇，2，劉茂柯，2*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.四川省瀘州市釀酒科學(xué)研究所，四川 瀘州 646100）

在濃香型白酒的生產(chǎn)過程中，因微生物因素引起的窖泥老熟慢嚴重制約優(yōu)質(zhì)白酒的產(chǎn)量[1]。為快速促進窖泥老熟，我國酒企紛紛致力于人工窖泥發(fā)酵劑（artificial pit mudstarter culture，APMSC）的制備[2-5]。人工窖泥發(fā)酵劑是將優(yōu)質(zhì)老熟窖泥在含有酒糟、曲藥和黃水等成分的液體培養(yǎng)基中富集馴化而制成的復(fù)合微生態(tài)制劑[6]。其研發(fā)思路是充分富集并利用老熟窖泥中的釀酒有益微生物資源培養(yǎng)人工窖泥新建窖池或用于窖池養(yǎng)護。盡管應(yīng)用效果顯著，但要實現(xiàn)人工窖泥發(fā)酵劑的質(zhì)量控制仍存在諸多困難。一是復(fù)合菌系的菌群結(jié)構(gòu)及相互作用易受環(huán)境因素影響導(dǎo)致功效不穩(wěn)定[7]；二是人工窖泥發(fā)酵劑的原料來源不穩(wěn)定，主要體現(xiàn)在優(yōu)質(zhì)老熟窖泥難獲取[6]；此外，不同來源酒糟、曲藥等原料的菌群結(jié)構(gòu)也存在明顯差異，可能導(dǎo)致批次間發(fā)酵劑功效的不穩(wěn)定[6]。

研究表明，釀造環(huán)境的選擇作用造就了窖泥、曲藥和酒糟之間微生物種群的相似性[8]。由此推測即使缺失某些培養(yǎng)原料，人工窖泥發(fā)酵劑的功能微生物也可能由其他原料補充，而原料種類的減少可降低原料因素對發(fā)酵劑功效的影響。本研究采用擴增子測序和色譜技術(shù)初步解析了培養(yǎng)原料種類的減少對人工窖泥發(fā)酵劑微生物群落結(jié)構(gòu)及應(yīng)用效果的影響。研究結(jié)果可為人工窖泥發(fā)酵劑原料配方的進一步優(yōu)化完善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試樣品

樣品包括前期開發(fā)的全配方人工窖泥發(fā)酵劑（intactartificial pit mud-starter culture，I-APMSC）及從其配方中分別取出老熟窖泥（窖齡＞30年）、曲藥、酒糟和黃水后形成的4個簡化人工窖泥發(fā)酵劑（simplified-artificial pit mud-starter culture，S-APMSC）配方，見表1。所有培養(yǎng)原料均來自同一酒企，各組發(fā)酵劑樣品（100 L）同時在30～35 ℃條件下靜置培養(yǎng)15 d。白酒樣品采自窖池養(yǎng)護后的第一輪釀造結(jié)束。窖池養(yǎng)護的主要流程是將窖池四壁的窖泥取下堆積在窖池中，按20%的接種量接種人工窖泥發(fā)酵劑后厭氧培養(yǎng)20 d。隨后將發(fā)酵后的窖泥重新搭在窖池四壁用于釀酒生產(chǎn)。設(shè)置未養(yǎng)護窖池為對照組（CK）（n=3）。

表1 不同配方人工窖泥發(fā)酵劑的主要原料Table 1 Main raw materials for artificial pit mud starter culture samples with different formulas

1.1.2 化學(xué)試劑

無水乙醇（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；氣相色譜檢測所用內(nèi)標及酒體香味物質(zhì)的標準品（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）抽提試劑盒：美國MPBiomedicals公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：1%乙酸鈉、0.1%酵母膏、硫酸0.05%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.02%和碳酸鈣1%，自然pH，無需滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R冷凍離心機：美國Eppendorf公司；Clarus 500氣相色譜儀：美國PerkinElmer公司；HC-806H電熱恒溫培養(yǎng)箱：南通精躍翔智能設(shè)備有限公司；15 kg電子秤：無錫英衡電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA基因組提取

取10 mL人工窖泥發(fā)酵劑樣品于4 ℃、12 000 r/min離心去除上清，采用總DNA抽提試劑盒提取沉淀物中的微生物DNA。

1.3.2 PCR擴增及16S rRNA基因擴增子測序

利用帶有測序接頭的特異性引物5'-CCT ACG GRR BGC ASC AGK VRV GAA T-3'和5'-GGA CTA CNV GGG TWT CTA ATC C-3'擴增原核微生物16S rRNA V3-V4區(qū)。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系及程序參照文獻進行[9]。采用Illumina Miseq平臺對PCR 產(chǎn)物進行2×300 bp雙末端高通量測序。測序文庫的構(gòu)建及測序由GENEWIZ公司完成。

1.3.3 香味物質(zhì)檢測

人工窖泥發(fā)酵劑預(yù)處理：取10 mL樣品于150 mL的三角瓶中，加入50 mL體積分數(shù)為65%乙醇溶液，振蕩搖勻，常溫下靜置24 h，取渾濁液5 mL于12 000 r/min離心10 min，取上清液進行檢測。白酒樣品的預(yù)處理方法參照文獻進行[10]。向2 mL 經(jīng)預(yù)處理的人工窖泥發(fā)酵劑和白酒樣品中各加入40 μL內(nèi)標（叔戊醇0.43 g/L、乙酸正戊酯0.42 g/L、2-乙基丁酸0.46 g/L），采用氣相色譜儀檢測香味物質(zhì)的含量，檢測條件參照文獻[9]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Qiime 軟件對16S rRNA擴增子測序獲得的原始序列進行優(yōu)化處理[9]。根據(jù)97%相似性將序列聚類成為分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[11]，將每個OTU的代表序列于核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomaldatabase project，RDP）[12]進行分類學(xué)比對，比對數(shù)據(jù)庫為Silva 119[13]。采用Qiime軟件計算多樣性指數(shù)Chao1和Shannon以描述微生物物種的多樣性[14]，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）表征人工窖泥發(fā)酵劑樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)及白酒樣品香味物質(zhì)組成的多樣性，通過STAMP軟件完成，韋恩（Venn）分析通過R軟件完成。微生物群落結(jié)構(gòu)與香味物質(zhì)含量的Pearson相關(guān)性分析、不同分組樣品間的微生物多樣性指數(shù)、相對豐度及香味物質(zhì)含量間的單因素方差分析均由SPSS 20.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工窖泥發(fā)酵劑的微生物多樣性

不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品的微生物物種多樣性指數(shù)見表2。由表2可知，除S-YW-APMSC外，其余簡化配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品的Chao1指數(shù)均顯著高于I-APMSC（P＜0.05），并且I-APMSC的Shannon指數(shù)顯著低于除S-ZPAPMSC 外的簡化配方（P＜0.05），說明簡化配方菌劑樣品中的微生物物種多樣性水平普遍高于I-APMSC。這可能是由于I-APMSC某些原料的微生物之間具有相互抑制作用所造成，其原因還需進一步研究。

表2 不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品的微生物物種多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity index in artificial pit mud starter culture samples with different formulas

不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分和韋恩分析見圖1。由圖1a可知，除I-APMSC外，其余樣品均按分組的不同良好聚類，說明I-APMSC的微生物群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的組內(nèi)分化。由圖1b可知，各分組樣品共有的OTU為50個，占OTU總量的71.43%（共70個OTU）；各組樣品中均未檢測到獨有的OTU，表明各組樣品的微生物種類高度相似。

圖1 基于OTU水平的不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析（a）和韋恩圖（b）Fig.1 Principal component analysis (a) and Venn diagram (b) of the microbial community structure in artificial pit mud starter culture samples with different formulas based on OTU level

2.2 人工窖泥發(fā)酵劑微生物的群落結(jié)構(gòu)組成

從所有人工窖泥發(fā)酵劑樣品中檢測到2 個細菌綱和16 個屬。不同配方人工窖泥發(fā)酵劑微生物在綱水平的組成情況見圖2。由圖2可知，S-PM-APMSC和S-ZP-APMSC樣品中梭菌綱（Clostridia）的相對豐度均顯著高于I-APMSC（P＜0.05），而芽孢桿菌綱（Bacilli）的相對豐度顯著低于其余發(fā)酵劑樣品（P＜0.05）。研究表明，梭菌綱（Clostridia）中的許多物種以己酸乙酯、己酸和丁酸等白酒主體香味物質(zhì)為代謝產(chǎn)物[15]。并且，窖泥質(zhì)量與梭菌綱（Clostridia）在窖泥中的相對豐度顯著正相關(guān)（P＜0.05），與芽孢桿菌綱（Bacilli）的相對豐度顯著負相關(guān)（P＜0.05）[16-17]。

圖2 不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品中梭菌綱（a）和芽孢桿菌綱（b）的相對豐度Fig.2 Relative abundance of Clostridia and Bacilli in artificial pit mud starter culture samples with different formulas

在屬水平上，本研究將在每組樣品中平均相對豐度＞1%的微生物類群定義為優(yōu)勢類群[17]。不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品中優(yōu)勢菌屬的相對豐度見表3。由表3可知，不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品中優(yōu)勢菌屬包括Caproiciproducens、梭菌屬（Clostridium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）和魯梅爾芽孢桿菌屬（Rummeliibacillus）。雖然配方不同，但所有樣品中都包含這些優(yōu)勢屬，僅在相對豐度方面存在顯著差異。其中，以己酸和丁酸為代謝產(chǎn)物的Caproiciproducens[18]在S-PM-APMSC樣品的相對豐度顯著高于其余發(fā)酵劑樣品（P＜0.05）；以己酸乙酯、己酸和丁酸等為主要代謝產(chǎn)物的梭菌屬（Clostridium）[15]在S-ZP-APMSC中的相對豐度顯著高于除S-QY-APMSC外的其余發(fā)酵劑樣品。Caproiciproducens和梭菌屬（Clostridium）的平均總相對豐度在S-ZP-APMSC和S-PM-APMSC中分別達到90.47%和96.67%，均高于其余分組。除Caproiciproducens和梭菌屬（Clostridium）外，乳桿菌屬（Lactobacillus）在I-APMSC 中也保持較高相對豐度，并顯著高于其余發(fā)酵劑樣品（P＜0.05）。有報道稱，乳桿菌屬（Lactobacillus）在窖泥中的大量累積可能是導(dǎo)致窖泥退化的原因之一[17，19]。結(jié)合綱水平的物種豐度組成可推測，S-PM-APMSC和S-ZP-APMSC對釀酒有益微生物的富集培養(yǎng)效果較好。

表3 不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品中優(yōu)勢菌屬的相對豐度Table 3 Relative abundance of dominant genera in artificial pit mud starter culture samples with different formulas

2.3 人工窖泥發(fā)酵劑微生物群落結(jié)構(gòu)與香味物質(zhì)的相關(guān)性

不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品中的香味物質(zhì)含量檢測結(jié)果見表4，人工窖泥發(fā)酵劑微生物群落結(jié)構(gòu)與香味物質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果見表5。

表4 不同配方人工窖泥發(fā)酵劑樣品中的香味物質(zhì)含量Table 4 Contents of flavor compounds contents in artificial pit mud starter culture samples with different formulas

表5 人工窖泥發(fā)酵劑樣品中優(yōu)勢微生物相對豐度與香味物質(zhì)含量的相關(guān)性Table 5 Correlation of relative abundance and flavor compounds content of dominant microbe in artificial pit mud starter culture samples

由表4可知，總體上S-PM-APMSC和S-ZP-APMSC樣品中乙酸、己酸乙酯和乙酸乙酯含量均高于其余分組樣品，S-QY-APMSC中的己酸乙酯含量顯著低于其余分組樣品（P＜0.05）。I-APMSC樣品中除己酸乙酯的含量較高，丁酸、乙酸和乙酸乙酯含量均處于中間水平。

由表5可知，Caproiciproducens與丁酸和乙酸的含量顯著正相關(guān)（P＜0.05）；芽孢桿菌屬（Bacillus）與乙酸、乙酸乙酯含量顯著負相關(guān)（P＜0.05）；片球菌屬（Pediococcus）與乳酸乙酯極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）與己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯的含量顯著負相關(guān)（P＜0.05）。魯梅爾芽孢桿菌屬（Rummeliibacillus）與丁酸乙酯含量顯著負相關(guān)。同時作為己酸和丁酸乙酯合成的關(guān)鍵前體物[1]，丁酸含量的提高有利于白酒質(zhì)量的增強，而乳酸乙酯在酒體中的含量過高會嚴重削弱白酒的質(zhì)量。在濃香型白酒的生產(chǎn)中，適當提高己酸乙酯和乳酸乙酯的含量比例是增強酒質(zhì)的有效手段[1]。因此，片球菌屬（Pediococcus）和芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）在人工窖泥發(fā)酵劑中含量過高可能造成窖泥中乳酸含量的提高，導(dǎo)致酒質(zhì)下降。

2.4 兩種人工窖泥發(fā)酵劑應(yīng)用效果的初步比較

利用S-PM-APMSC和I-APMSC進行窖池養(yǎng)護，并檢測養(yǎng)護后第一輪釀造白酒樣品中的38種香味物質(zhì)含量。養(yǎng)護窖池釀造白酒樣品的主成分分析結(jié)果見圖3，香味物質(zhì)含量見表6。由圖3可知，各組白酒樣品均未被較好的聚類，表明組內(nèi)樣品間的變異較大。由表6可知，在所檢測的香味物質(zhì)中，16 種香味物質(zhì)的含量具有組間差異（P＜0.05）。除甲酸乙酯外，S-PM-APMSC和I-APMSC白酒樣品中的油酸乙酯、亞油酸乙酯、十四酸乙酯和葵酸乙酯的含量較對照組顯著提高（P＜0.05）。酸類物質(zhì)中，S-PM-APMSC和I-APMS白酒樣品中己酸含量有所提高，而丁酸顯著下降（P＜0.05）。雖未達到顯著水平，S-PM-APMSC和I-APMSC 白酒樣品中的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯含量均較高，其中己酸乙酯含量分別提高了32.51%和71.18%。其余指標如總酯、總醇和總酸等含量具有不同程度提高。

圖3 不同配方人工窖泥發(fā)酵劑養(yǎng)護窖池釀造白酒樣品的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of Baijiu samples fermented in cellars prepared by artificial pit mud starter culture with different formulas

表6 釀造白酒樣品中的香味物質(zhì)含量Table 6 Content of flavor compounds in Baijiu samples

3 討論

本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，即使保持培養(yǎng)條件一致，生產(chǎn)批次間甚至同一批次的人工窖泥發(fā)酵劑感官性狀也會出現(xiàn)明顯差異，其中感官正常的發(fā)酵劑以Caproiciproducens和梭菌屬（Clostridium）占優(yōu)，而劣質(zhì)發(fā)酵劑以乳桿菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）占優(yōu)[20]。因此，課題組認為感官性狀可在一定程度上反映人工窖泥發(fā)酵劑功能微生物的組成，并嘗試從感官特征制定一種質(zhì)量評價的方法。但本研究發(fā)現(xiàn)即使感官正常，I-APMSC中的乳桿菌屬（Lactobacillus）仍保持顯著優(yōu)勢，且該組樣品在PCA圖譜中未被良好聚類，說明組內(nèi)樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的變異較大。這再次體現(xiàn)了要培養(yǎng)穩(wěn)定高效的復(fù)合微生態(tài)制劑所面臨的巨大難度，也說明人工窖泥發(fā)酵劑質(zhì)量評價體系的制定應(yīng)從感官和微生物群落結(jié)構(gòu)等多方面著手。由于人工窖泥發(fā)酵劑的功能微生物主要來自培養(yǎng)原料，實現(xiàn)其品質(zhì)控制的主要手段之一是要加強原料質(zhì)量的控制[6]?；谠祥g菌群結(jié)構(gòu)的相似性[8]，本研究認為即使去除某些培養(yǎng)原料，人工窖泥發(fā)酵劑的功能微生物也可由其他原料補充，而原料的精簡是減少影響功效因素的重要途徑。本研究結(jié)果也證實了這一推測。其中最有力的證據(jù)來自于韋恩分析中所有分組樣品共享了占總量71.43%的OTU，且在各組樣品中均未檢測到獨有的OTU。其次，各分組樣品中的優(yōu)勢菌屬均在其余分組中存在，唯一的區(qū)別體現(xiàn)在物種豐度的差異。如老熟窖泥的缺失造成Caproiciproducens相對豐度的顯著提高，而老熟窖泥、黃水、酒糟和曲藥的缺失均分別導(dǎo)致了乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度的顯著下降（P＜0.05）?；诖?，本研究認為人工窖泥發(fā)酵劑培養(yǎng)原料種類的減少可能會導(dǎo)致某類微生物豐度的變化，但這可在將來通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來對物種豐度進行調(diào)控，以彌補原料缺失造成的影響。

利用S-PM-APMSC和I-APMSC進行窖池養(yǎng)護后，兩組白酒樣品中的己酸和己酸乙酯等主體香味物質(zhì)含量均有提高，說明兩種配方均取得了良好效果，從實踐上再次證明了通過減少原料種類來改良人工窖泥發(fā)酵劑配方的可行性。

4 結(jié)論

本研究采用擴增子測序和色譜技術(shù)初步解析了培養(yǎng)原料種類的減少對人工窖泥發(fā)酵劑微生物群落結(jié)構(gòu)及應(yīng)用效果的影響。研究結(jié)果證實，即使缺失了某一種培養(yǎng)原料，人工窖泥發(fā)酵劑的主要微生物物種也可能由其他原料補充。其中，不以老熟窖泥為原料制備的發(fā)酵劑中釀酒有益微生物豐度和主體香味物質(zhì)含量均較原配方發(fā)酵劑有所提高，其養(yǎng)護窖泥的應(yīng)用效果未發(fā)生改變。本研究結(jié)果為人工窖泥發(fā)酵劑原料配方的進一步優(yōu)化完善奠定了基礎(chǔ)。