李 曄，陳振婭，王瑞麗，沈 榮，危 晴，陳 亮

（1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院 生物工程學(xué)院，北京 100176；2.北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是糖胺多糖的一種，是以D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧硫酸-D-半乳糖通過β-1,3糖苷鍵相結(jié)合的雙糖為基本單位，聚合而成的一類大分子多糖，雙糖單位數(shù)目一般在50～70個，分子質(zhì)量約在5～50 kDa之間。糖胺多糖作為蛋白聚糖的組成成分，主要分布在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面，用來指導(dǎo)很多生物過程，如細(xì)胞增殖、信號傳輸和炎癥介導(dǎo)等[1-3]。

硫酸軟骨素酶（chondrotinase，ChSase）是一類能將糖胺聚糖催化裂解為小分子多糖的酶，ChSase根據(jù)其作用底物的不同分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等類型。盡管CS已有很多的藥效，但小分子的CS藥效更為顯著。小分子的硫酸軟骨素（CS），以硫酸軟骨素為主體構(gòu)成的可聚蛋白聚糖在軟骨基質(zhì)中起著一種“分子彈簧”的作用，具有止痛，促進(jìn)軟骨再生的功效，可從根本改善關(guān)節(jié)問題。ChSase ABC還具有緩解視網(wǎng)膜變性[4]，提高后肢運動能力[5]，降解囊性纖維變性部位的黏液物，緩解突出椎間盤癥狀[6-8]。另外，LEE M C等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)軟骨用ChSase ABC處理后，移植的軟骨細(xì)胞與軟骨創(chuàng)面的黏附能力大大增強。

ChSase ABC分為I和II，ChSase ABC I的晶體結(jié)構(gòu)與ChSase ABC II相似，主要包含三個主要的區(qū)域，N-端區(qū)域有雙層的β-折疊，催化區(qū)域有雙層的（α/α）5的折疊和C-端的反平行β-折疊區(qū)域[10]，ChSase ABC I在相同底物的作用下催化效率比ChSase ABC II高，ChSase ABC I的米氏常數(shù)（Km）比ChSase ABC II低，最大反應(yīng)速率（Vmax）比ChSase ABC II高[11]。

ChSase ABC I由997個氨基酸殘基構(gòu)成，ChSase ABC II由990個氨基酸殘基構(gòu)成[11]。通過重原子置換法和多波長反常散射法技術(shù)分析，ChSase ABC I在1.9? 的分辨率下R因子和自由R因子分別為0.157和0.214，具有很好的立體化學(xué)性[12]。ChSase ABC I的N端是由1～210位的氨基酸構(gòu)成的雙層β折疊和一個短的α螺旋，該區(qū)域的氨基酸序列與裂解碳水化合物酶相似，如木聚糖酶和一些凝集素。中間區(qū)域是由211～593位氨基酸構(gòu)成的15個α螺旋，是主要的催化區(qū)域。C端是由594～997位氨基酸構(gòu)成的4個反向平行的β折疊，氨基酸序列與ChSase AC酶的C端有21%的相似性，與肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的透明質(zhì)酸酶有17%～19%的相似性，ChSase ABC I的C端氨基酸的主要作用是裂解CS A、CS C 和透明質(zhì)酸[13]。

ChSase ABC II的晶體結(jié)構(gòu)與ChSase ABC I非常相似，主要包含3個主要的區(qū)域，N端是由14～170位的氨基酸構(gòu)成的雙層β折疊，且Ca2+結(jié)合在第二和第三個β鏈之間。中間區(qū)域是由171～593位氨基酸構(gòu)成的雙層的（α/α）5折疊，與ChSase AC，透明質(zhì)酸裂解酶，黃原膠裂解酶和肝素酶II相似，有一個與底物結(jié)合區(qū)域。C端是由594～1 014位氨基酸構(gòu)成的4個反向平行的β折疊[12，14]。與ChSase AC結(jié)構(gòu)對比后，推測其活性位點為His454，Tyr461，Arg514和Glu628，同樣通過定點突變實驗驗證了推測結(jié)果[15]。

目前也有許多關(guān)于ChSase ABC的固定化和穩(wěn)定性的研究，但是這些酶大多都是從菌株中分離得到，分離步驟繁瑣，且得到的酶活較低，酶的主要來源為彭氏變形桿菌（Proteus penneri）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），酶活為0.3 U/mL和0.9 U/mL[16-20]。目前重組菌構(gòu)建越來越受到關(guān)注，ChSase ABC重組菌也越來越多，但是仍然面臨著許多的困難：一方面通過菌體表達(dá)得到的重組酶，多數(shù)都以包涵體形式表達(dá)，再經(jīng)過后續(xù)的包涵體分離純化及復(fù)性，得到的酶量有限。另一方面ChSase ABC的分離純化，常用的是硫酸銨沉淀法，這種方法的成本很高，是制約酶工業(yè)化生產(chǎn)的主要瓶頸。融合蛋白主要由兩部分組成，即功能蛋白和連接肽。功能蛋白為所要融合的具有特定功能活性的原始蛋白，通常結(jié)構(gòu)功能已知，選擇上不存在困難。而連接肽由于其在融合蛋白整體結(jié)構(gòu)中的重要性，在選擇和設(shè)計上需要加以研究思考[21-23]，從而確保融合蛋白的整體活性不變[24]。因此，本研究選用兩種連接肽與目的蛋白進(jìn)行融合，首次將來源于普通變形桿菌（Proteus vulgaris）KCTC 2579的ChSase ABC I與麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binging protein，MBP）分別用FFFFF和RRRRR兩種連接肽連接，并克隆到pMAL-c2X載體上，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）高效表達(dá)，并且利用直連淀粉柱實現(xiàn)了一步純化，并探究了這兩種柔性和剛性連接肽在ChSase ABC I表達(dá)中的影響。為該酶的基因改造提供一種新手段，為酶的性質(zhì)優(yōu)化和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通變形桿菌（Proteusvulgaris）KCTC2579：韓國KCTC保藏中心；E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：北京博邁德生物技術(shù)有限公司；pMAL-c2x：本實驗室保存；FFFFF、RRRRR：北京普爾普樂生物技術(shù)有限公司合成；Q5TMHigh-Fidelity 2×Master Mix、T4連接酶和所有的限制性內(nèi)切酶：New England Biolabs公司；硫酸軟骨素A（分子質(zhì)量為50 000）：南京奧多福尼生物科技有限公司；細(xì)菌全基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒：美國OMEGA公司；其他試劑均國產(chǎn)分析純。

Proteus vulgarisKCTC 2579采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏提取物0.3%，蛋白胨0.5%，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

全合成的RRRRR基因序列為：5'-GTCGATGAAGCC CTGAAAGACGCGCAGACTGAGGCTGCCGCAAAGGAA GCGGCAGCGAAAGAGGCGGCCGCAAAAGAGGCAGC GGCGAAAGAAGCTGCGGCCAAGCTCGAGGCCACCAG CAATCCTGCATTTGATCCTAAAAATC-3'

全合成的FFFFF基因序列為：5'-CTGTCGATGAAGC CCTGAAAGACGCGCAGACTGGTGGTGGCGGCAGCGG TGGCGGCGGTAGCGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGG TGGTTCTGGTGGTGGTGGCAGCCTCGAGGCCACCAG CAATCCTGCATTTGATCCTAAAAATCTGAT-3'

1.2 儀器與設(shè)備

1-14K離高速冷凍離心機：美國Sigma公司；MBPTrapHP親和柱（1 mL）：美國GE Healthcare公司；HT-400B恒溫培養(yǎng)箱：上海赫田科學(xué)儀器有限公司；ZQZY-78AV搖床：上海知楚儀器有限公司；DYCP-31CN型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；165-8001蛋白電泳儀：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMALc2x-RRRRR-ChSase ABC I的構(gòu)建

將ProteusvulgarisKCTC2579從安培管中接入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，菌體12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用OMEGA公司細(xì)菌全基因組提取試劑盒提取基因組，以此為模板，并采用Q5TMHigh-Fidelity2×Master Mix對ChSase ABC I進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。根據(jù)已知的ChSase ABC I基因序列（GenBank：GQ996964.1）設(shè)計PCR引物，ChSase ABC I-F：5'-GCCACCAGCAATCCTGCATTTGATCCTAAA-3'，ChSase ABC I-R：5'-AGAGGATCCGAATTCTTATCAAGGGAGTGGCGAGAGTTTGATTTCT-3'。以pMAL-c2x為模板，以MBP-F：CCGTTTAGGTGTTTTCACGA，MBP-R：AGTCTGCGCGTCTTTCAGGG為引物，PCR獲得MBP基因。

以MBP、FFFFF、ChSase ABC I 為模板，MBP-F/ChSase ABC I-R為引物，PCR 擴增得到MBP-FFFFF-ChSase ABC I基因；以MBP，RRRRR，ChSase ABC I 基因為模板，MBP-F/ChSase ABC I-R為引物，PCR擴增得到MBP-RRRRR-ChSase ABC I基因。

將擴增得到的MBP-FFFFF-ChSaseABCI，MBP-RRRRRChSase ABC I和pMAL-c2x基因均用NdeI/EcoRI酶切，酶切后進(jìn)行膠回收。然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α，并進(jìn)行菌落PCR，酶切和測序驗證。

1.3.2 重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMALc2x-RRRRR-ChSase ABC I轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）中，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體接種到預(yù)先滅菌的裝有4 mL LB培養(yǎng)基和100 μg/mL氨芐青霉素的試管中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，作為種子液。按1%的接種量將種子液接到裝液量為50 mL/250 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD600nm值為0.6左右）。加入一定量異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）至濃度為0.5 mmol/L，16 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)20 h。

1.3.3 重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)20 h后的菌，6 000 r/min條件下離心6 min，并用適量的水洗菌體。加入適量的Tris-HCl，pH 7.4緩沖液重懸菌體，超聲破碎菌體，超聲條件為：超聲5 s，間歇6 s，超聲功率0.3 kW，破碎總時間為15 min。破碎時要保證低溫破碎。破碎液離心后收集上清，并用0.22 μm濾膜過濾上清，過濾后置于冰上備用，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證蛋白大小。按照直鏈淀粉柱的說明書上的一步純化的方法進(jìn)行親和分離純化。

1.3.4 酶活及酶比活測定

重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I 和MBP-RRRRRChSase ABC I可裂解底物硫酸軟骨素A為4,5-不飽和糖醛酸產(chǎn)物，此產(chǎn)物在232 nm波長處有強烈吸收，故通過在波長232 nm處測定吸光度值，計算重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活[25-26]。蛋白濃度測定采用Bradford法。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果驗證

PCR擴增得到MBP、ChSase ABC I、MBP-FFFFF-ChSase ABCI和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的基因見圖1。已知MBP基因片段的堿基長度為1 173 bp，ChSase ABC I基因片段的堿基長度為3 000 bp，RRRRR基因片段的堿基長度為145 bp，F(xiàn)FFFF基因片段的堿基長度為151 bp。所以可以計算得知，MBP-RRRRR-ChSaseABCI基因片段的堿基長度為4 318 bp，MBP-FFFFF-ChSase ABC I基因片段的堿基長度為4 324 bp。由圖1可知，PCR擴增得到的MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSaseABCI的堿基長度與預(yù)期一致，故PCR擴增已成功獲得MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的基因。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR結(jié)果Fig.1 Results of PCR verification by agarose gel electrophoresis

2.2 重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I的構(gòu)建

連接轉(zhuǎn)化后獲得的陽性轉(zhuǎn)化子，通過提取質(zhì)粒和酶切驗證，用NdeI/EcoRI酶切驗證重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFFChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I，結(jié)果見圖2。由圖2可知，成功獲得5 473 bp和4 318 bp，5 473 bp和4 324 bp的基因片段，表明已成功獲得重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I。測序結(jié)果同樣表明已成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFFChSaseABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I。

圖2 重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMAL-c2x-RRRRR-ChSase ABC I經(jīng)Nde I/EcoR I酶切產(chǎn)物Fig.2 Enzyme-digested product of recombinant plasmids pMALc2x-FFFFF-ChSase ABC I and pMAL-c2x-RRRRRChSase ABC I by Nde I/EcoR I

2.3 重 組 酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I 和MBP-RRRRRChSase ABC I的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I和pMALc2x-RRRRR-ChSase ABC I分別轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）中，在相同的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果見圖3。分別測定蛋白濃度，酶活力和酶比活，結(jié)果見表1。

圖3 重組質(zhì)粒pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I裂解底物硫酸軟骨素A后的全掃描圖Fig.3 Full scan of chondroitin sulfate cracked by recombinant plasmid pMAL-c2x-FFFFF-ChSase ABC I

由圖3可知，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBPRRRRR-ChSase ABC I可裂解底物硫酸軟骨素A為4,5-不飽和糖醛酸產(chǎn)物，此產(chǎn)物在波長232 nm處有強烈吸收。結(jié)果表明，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I已成功表達(dá)，同樣方法驗證了重組酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I也成功表達(dá)。

表1 重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I酶活、蛋白含量及比酶活Table 1 Activities,protein contents and specific enzyme activities of recombinases MBP-FFFFF-ChSase ABC and MBPRRRRR-ChSase ABC I

由表1可知，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為716.5 IU/L發(fā)酵液和1.15 IU/mg蛋白，重組酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為741.0 IU/L發(fā)酵液和1.13 IU/mg蛋白。剛性連接肽RRRRR的總酶活比柔性連接肽FFFFF的總酶活高。剛性連接肽RRRRR的菌體量、蛋白含量比柔性連接肽FFFFF的高。

2.4 SDS-PAGE驗證重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子質(zhì)量

SDS-PAGE測定重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子質(zhì)量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I已在BL21（DE3）中成功表達(dá)，并且獲得了可溶性的重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I，上清液基本包含了90%以上的總蛋白。SDSPAGE結(jié)果表明，重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBPRRRRR-ChSase ABC I的分子質(zhì)量均為130 kDa。

圖4 SDS-PAGE驗證重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I分子質(zhì)量Fig.4 Verification of molecular mass of recombinases MBP-FFFFFChSase ABC I and MBP-RRRRR-ChSase ABC I by SDS-PAGE

3 討論

本研究通過一步親和純化的方法獲得重組酶MBPFFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I。采用直連淀粉柱親和MBP實現(xiàn)一步純化，MBP可以與直鏈淀粉結(jié)合，從而吸附在直鏈淀粉柱上，再利用親和力更強的麥芽糖將MBP-HepC融合蛋白洗脫，利用此特性實現(xiàn)重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的親和純化。本研究表明直鏈淀粉柱能夠有效地吸附重組酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC，通過一步親和分離純化，目標(biāo)蛋白的純度即可達(dá)95%以上，大大縮減了純化步驟并降低了分離純化成本。

ChSase ABC I的發(fā)展同樣還受到諸多因素的限制，需從以下幾方面入手來改變現(xiàn)狀，首先，需要尋找新型菌株，表達(dá)策略及代謝途徑來實現(xiàn)酶的高效分泌表達(dá)，避免后續(xù)的包涵體復(fù)性對酶活性的影響，實現(xiàn)其在工業(yè)化中的應(yīng)用。其次，通過構(gòu)建含有不同標(biāo)簽的融合表達(dá)載體來實現(xiàn)酶快速和高效分離純化。最后，需研究新方法來增強酶的熱穩(wěn)定性，延長酶的保藏時間，如尋找耐熱菌來源的ChSase ABC I等。另外，ChSase ABC I的固定化也是研究的一個重要方面，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，如何找到能夠承載ChSase ABC I的合適的藥物載體，來協(xié)助其完成特定的藥效功能是亟待解決的問題。

4 結(jié)論

ChSaseABCI是一類能夠?qū)⒘蛩彳浌撬亍④浌撬?、透明質(zhì)酸等糖胺多糖降解為寡糖及不飽和二糖的裂解酶。本研究所用的ChSase ABC I基因來源于Proteus vulgarisKCTC 2579，首次將ChSase ABC I與麥芽糖結(jié)合蛋白分別用FFFFF和RRRRR兩種連接肽連接，并克隆到pMAL-c2x載體上，成功在E.coliBL21（DE3）高效表達(dá)。表達(dá)后重組酶MBP-FFFFFChSase ABC I的酶活和比酶活分別為716.5 IU/L發(fā)酵液和1.15 IU/mg蛋白，重組酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為741.0 IU/L發(fā)酵液和1.13 IU/mg蛋白。SDS-PAGE表明MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRRChSase ABC I的分子質(zhì)量均為130 KDa，并且基本都為可溶性蛋白。