汪地強，陳良強，涂昌華*，秦 興，袁 頡，錢書楊

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

白酒釀造工藝在中國已經(jīng)有一千多年的歷史，其獨樹一幟的特點便是利用自然發(fā)酵[1]。醬香型白酒釀造過程中的高溫堆積工藝作為大曲酒生產(chǎn)工藝中較為獨特的一環(huán)能夠通過網(wǎng)羅環(huán)境中的微生物進行發(fā)酵[2-4]，同時代謝產(chǎn)生如醇類[5]、有機酸類、酯類、醛類和吡嗪類[6]等多種酒體香味物質(zhì)及前體物質(zhì)，并為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件[7]。堆積前期，空氣流通，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，酒醅中各種微生物生長代謝旺盛，特別是酵母菌和霉菌[8-9]，堆積后期，酒醅溫度較高，不同部位氧氣濃度存在差異，微生物經(jīng)自然馴化，為入窖發(fā)酵提供微生物基礎(chǔ)[10-11]。韓興林等[12]在對醬香白酒堆積發(fā)酵過程中代謝風(fēng)味生成規(guī)律的分析中提出，堆積過程富集的微生物能夠產(chǎn)生大量酒體風(fēng)味物質(zhì)，與各輪次醬香基酒的品質(zhì)具有一定的關(guān)聯(lián)性。周恒剛等[13-14]對比研究了堆積發(fā)酵和不堆積發(fā)酵對醬香型白酒酒質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)酒醅不堆積直接入窖會導(dǎo)致不產(chǎn)酒或產(chǎn)酒質(zhì)量差等情況，表明堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)中不可忽視的一個環(huán)節(jié)。

在醬香型白酒冬季生產(chǎn)過程中，堆積酒醅內(nèi)部或表層處會出現(xiàn)酒醅表面呈白色或微黃色，在濕度大、發(fā)酵溫度高的環(huán)境條件下易成團狀，或帶“霉味”，且酒醅干燥，下窖時酒精味較濃。這種現(xiàn)象在醬香型白酒生產(chǎn)上被稱為“腰線”[15]。

江鵬等[15]提出腰線的形成主要原因是由于排與排之間酒醅溫差過大、過度糊化以及水分作用造成的發(fā)酵現(xiàn)象，但是對于不同種類的腰線并未進行深入研究。因此，本研究分析了不同腰線酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)、真菌組成與代謝特征，以及二者的關(guān)系，有助于認識腰線酒醅在醬香型白酒生產(chǎn)過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腰線酒醅樣品：取自某醬香型白酒生產(chǎn)車間，為一輪次堆積酒醅，具體信息如表1。

表1 不同類型腰線酒醅樣品信息Table 1 Information of different types of fermented grains

氯化鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone，YPD）培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；固態(tài)模擬發(fā)酵培養(yǎng)基：將高粱粉碎，利用超純水調(diào)節(jié)水分至60%，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MPSⅡ自動頂空固相微萃取裝置（solid-phase microextraction，SPME）：德國Gerstel公司；安捷倫7890A氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ME4002E電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；ALP高溫滅菌鍋：昆明倍捷科技有限公司；AFZ-2002-U型超純水系統(tǒng)：美國艾科浦國際有限公司；ESCO超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；SPX-250B-2型恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海飛越實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅微生物分離純化與計數(shù)方法

采用稀釋涂布法對不同腰線酒醅樣品的酵母與霉菌進行分離，培養(yǎng)基稀釋度分別為10-4、10-5、10-6，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。3 d后按GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》中平板計數(shù)法對酵母菌計數(shù)，并對不同形態(tài)菌株進行分離與純化。7 d后，按同樣方法對霉菌菌落計數(shù)與分離。

1.3.2 單菌株固態(tài)模擬發(fā)酵

將腰線樣品中分離得到的不同形態(tài)特征的菌株利用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)7 d進行固態(tài)模擬發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，進行代謝產(chǎn)物分析。

1.3.3 固態(tài)樣品風(fēng)味物質(zhì)檢測方法

于20 mL頂空樣品瓶中加入3 g酒醅樣品，通過頂空固相微萃取技術(shù)（head-spacesolidphasemicroextraction，HS-SPME）進行萃取，再利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀進樣分析。氣相色譜分離條件：柱溫初始溫度為60 ℃，以6 ℃/min的升溫速率升至230 ℃，保持15 min；柱流量1.6 mL/min，采用恒壓模式；進樣口溫度230 ℃。質(zhì)譜條件：電子能量為70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；采用全掃描方式（scan），使用35～550 amu的質(zhì)量范圍，溶劑延遲5 min。將未知物質(zhì)圖譜與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）08a.L Database中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對，進行定性分析。采用面積歸一化法確定相對含量。

1.3.4 數(shù)量處理分析

將得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰面積進行歸一化處理后，利用R語言3.6.1版本，pheatmap和VennDiagram包對腰線酒醅樣品的風(fēng)味物質(zhì)進行熱圖（heatmap）和韋恩圖（venn）分析；利用igraph包對菌株代謝產(chǎn)物進行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腰線酒醅風(fēng)味組成分析

對不同腰線酒醅風(fēng)味檢測發(fā)現(xiàn)，共獲得45種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類10種，酸類8種，酯類6種。利用R語言對四種酒醅風(fēng)味物質(zhì)檢測數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，得出不同類型腰線酒醅風(fēng)味總量依次為D3＞D2＞D4＞D1；堆積5 d內(nèi)部白色樣品D3的風(fēng)味物質(zhì)種類最多，達40種，其次是堆積11 d的外部白色樣品D2與堆積8 d的內(nèi)部白色樣品D4，均為32種，外部黃色樣品D1的種類最少，為21種。其中（2R，3R）-丁二醇、β-乙基苯乙醇、苯甲醇、苯乙醇、異戊醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、愈創(chuàng)木酚、乙偶姻等17種風(fēng)味物質(zhì)是四個樣品共有的。這可能是由腰線酒醅的位置、溫度、堆積時間、微生物種類等特點共同影響的[16]。

D3樣品堆積5 d，此時微生物代謝旺盛，且處于酒醅內(nèi)部，堆積溫度為37 ℃，不利于風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)，所以風(fēng)味物質(zhì)含量最高；而D1堆積時間較長，微生物生長代謝較穩(wěn)定，且位于表層，堆積溫度達45 ℃，疏松度較高，易于風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)和前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，因此風(fēng)味物質(zhì)含量較低。

對比不同種類風(fēng)味物質(zhì)含量，乙酸含量最高，其次為苯乙醇，再次為乳酸乙酯。酒醅中的乙酸主要由醋酸菌在堆積過程產(chǎn)生，苯乙醇主要由酵母菌代謝產(chǎn)生[17]，4種酒醅均檢出苯乙醇，推測4種酒醅均含有一定數(shù)量的酵母菌，其中D2的苯乙醇含量明顯高于D1，可能是D1還含有大量霉菌，影響了酵母菌的生長代謝[18]。

圖1 不同堆積發(fā)酵酒醅風(fēng)味物質(zhì)含量熱圖（a）及種類Venn圖（b）Fig.1 Heat map of flavor contents (a) and Venn diagram (b) of flavor substances categories in different accumulated fermented grains

2.2 不同腰線酒醅的真菌數(shù)量

通過兩種不同培養(yǎng)基的微生物計數(shù)結(jié)果可知，堆積發(fā)酵酒醅中酵母菌數(shù)在106～108CFU/g之間，霉菌數(shù)在104～107CFU/g之間，表明堆積發(fā)酵過程中的真菌數(shù)量豐富，無論是好氧微生物，還是兼性厭氧微生物都能在這一過程中大量生長，而這與堆積發(fā)酵酒醅兼具有氧環(huán)境和無氧環(huán)境相關(guān)，因此在不同位置酒醅樣品的微生物種類組成也會有較大的差異性，從而造成酒醅風(fēng)味成分和含量的區(qū)別。對4個樣品中的霉菌和酵母菌分離純化，并根據(jù)計數(shù)結(jié)果分析酒醅樣品的真菌結(jié)構(gòu)。

圖2 4個酒醅樣品的真菌結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal structure of 4 fermented grains samples

由圖2可知，D1的霉菌數(shù)量最多，尤其是擬青霉，可以達到5.6×107CFU/g，使酒醅的顏色呈微黃色。而D2則有最多的酵母菌計數(shù)結(jié)果，尤其是庫氏畢赤酵母，可以達到2.29×108CFU/g，因此酒醅的顏色呈白色。D4無論是霉菌數(shù)量，還是酵母菌數(shù)量都低于D1和D2，而這可能與發(fā)酵時長和所處位置相關(guān)。雖然D1和D2所含的主要菌種分別為擬青霉和庫氏畢赤酵母，但是在D1中也檢出較為豐富的酵母菌，為1.76×108CFU/g；D2中也同樣含有少量的擬青霉，為2×106CFU/g。說明腰線酒醅堆積發(fā)酵是多種微生物共同生長代謝所產(chǎn)生的結(jié)果，其中影響較大的主要是擬青霉和非產(chǎn)酒酵母菌。

D3和D4分別是5 d和8 d位于內(nèi)部腰線酒醅，都為白色。與D1和D2相比，D3和D4的菌群結(jié)構(gòu)更為多樣，且發(fā)酵8 d的酒醅樣品的霉菌和酵母菌菌落數(shù)量也比發(fā)酵5 d的酒醅樣品更多，但相較于D1和D2中的部分微生物仍要小幾個數(shù)量級，說明在堆積發(fā)酵階段前期主要是各種微生物的積累階段，此時由于環(huán)境適宜，尚不存在某種或某幾種突出的優(yōu)勢菌種能夠?qū)ζ渌N造成抑制，如D1的擬青霉和D2的庫氏畢赤酵母，因此酒醅的性狀是存在較小的白點。同時，由于霉菌屬于好氧菌，但在D3和D4中也能檢測出大量霉菌的存在，意味著酒醅內(nèi)部也存在微氧環(huán)境，而這與茅臺酒生產(chǎn)工藝中對于酒醅的疏松度要求相關(guān)。

2.3 代謝產(chǎn)物分析

將分離出的3株霉菌和3株酵母菌進行單菌株固態(tài)模擬發(fā)酵，待發(fā)酵完全后對培養(yǎng)基中的風(fēng)味物質(zhì)做檢測分析，分離出來的微生物與培養(yǎng)基中風(fēng)味物質(zhì)的種類之間的關(guān)系如圖3所示。

由圖3可知，酒醅空白樣品為堆積發(fā)酵酒醅發(fā)酵代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，共有19種，其中醇類2種，酸類5種，酯類5種。霉菌YM5能夠特異性地代謝乳酸乙酯，因此含YM5較多的D3樣品中的乳酸乙酯含量最高。酵母菌能夠特異性地代謝11種風(fēng)味物質(zhì)，主要為酸類化合物、酯類化合物和醇類化合物，因此酵母豐度較高的D2、D3和D4中的風(fēng)味物質(zhì)種類明顯較擬青霉豐度是絕對優(yōu)勢菌種的D1多，與MENG X等[19]的研究結(jié)果一致。由此可知，堆積過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)占總的風(fēng)味物質(zhì)的大部分，但是腰線中的微生物代謝卻能夠充分補充酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，尤其是各種酵母菌的代謝產(chǎn)物。WU Q等[20-22]提出白酒發(fā)酵中風(fēng)味物質(zhì)的多樣性來源于內(nèi)源微生物和外源微生物之間的代謝競爭，而腰線層內(nèi)部會受到原生微生物的影響，外部直接與空氣接觸，因此有多種霉菌和酵母菌等好氧或兼性厭氧微生物的大量生長繁殖，從而造就了腰線層酒醅的特殊性。

圖3 微生物與風(fēng)味代謝物質(zhì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of the relationship between microorganisms and flavor metabolites

3 結(jié)論

通過對不同腰線酒醅風(fēng)味物質(zhì)進行對比，得出酒醅風(fēng)味物質(zhì)總量依次為：D3＞D2＞D4＞D1，可能是由于不同腰線酒醅的位置、溫度、堆積時間等因素的差異影響了微生物的代謝結(jié)果；堆積5 d內(nèi)部白色樣品D3的風(fēng)味物質(zhì)種類最多，達40種，其次是堆積11 d的外側(cè)白色樣品D2與堆積8 d的內(nèi)部白色樣品D4，均為32種，外部黃色腰線酒醅D1的種類最少，為20種，共有17種風(fēng)味物質(zhì)在4個樣品中均有檢出；不同種類風(fēng)味物質(zhì)中，乙酸含量最高，其次為苯乙醇，再次為乳酸乙酯。

對比不同酒醅微生物計數(shù)結(jié)果可知，堆積發(fā)酵酒醅中酵母菌在106～108CFU/g，霉菌在104～107CFU/g之間，表明堆積發(fā)酵過程中的真菌數(shù)量豐富，這與堆積發(fā)酵酒醅兼具有氧環(huán)境和微氧環(huán)境相關(guān)；其中D1樣品中擬青霉數(shù)量最多，導(dǎo)致樣品呈微黃色，D1、D2、D4樣品含有大量酵母菌，因此呈白色。進一步分離純化樣品中的霉菌和酵母菌，進行代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)腰線酒醅中的微生物代謝過程能夠增加酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。

上述腰線酒醅風(fēng)味物質(zhì)的差異主要是由于微生物菌群結(jié)構(gòu)不同，從而使得微生物代謝產(chǎn)物不同。為了更好地分析四種酒醅菌群結(jié)構(gòu)與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系，還需對酒醅微生物進行分離、純化，進一步研究不同真菌利用高粱發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的差異。