張文泉，羅國濤，閆 偉

（1.凱里學院，貴州 凱里 556011；2.內蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010019）

塊菌又稱為松露、豬拱菌，是塊菌科Tuberaceae塊菌屬Tuber外生菌根的子實體，在歐美地區(qū)稱之為廚房中的黑寶石，營養(yǎng)豐富，價值極高[1]。研究表明：全球范圍內，塊菌屬真菌，約60種以上，世界范圍均有分布[2-5]，多集中在溫帶森林地區(qū)，在干旱的荒漠、半荒漠地帶及亞熱帶的林區(qū)偶有發(fā)現(xiàn)。我國主要分布于東北到西南地區(qū)這一條帶上，云南、四川等省尤其豐富，西北的新疆、西藏、內蒙古、甘肅等地均見報道，多出現(xiàn)于海拔1 500 m以上的針葉林或針闊混交林下。對中國塊菌的分布、種類及數(shù)量進行研究及統(tǒng)計[6-12]得出：中國近13個省市自治區(qū)發(fā)現(xiàn)有塊菌分布，種類達30種。以往對塊菌種類的鑒定多采用形態(tài)學上的分類方法，但由于環(huán)境因子及地域差異，造成同一菌根真菌所形成的外生菌根形態(tài)上的變化千差萬別，導致分類上出現(xiàn)分歧，隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，分子生物學技術在菌根分類學上的應用，塊菌的分類鑒定進入新的階段，目前，多采用ITS區(qū)段的基因核酸序列分析對塊菌種類進行鑒定。

本研究在對雷公山國家級自然保護區(qū)外生菌根真菌進行資源調查中發(fā)現(xiàn)存在塊菌屬的外生菌根真菌，故對其進行進一步調查研究。

1 研究地概況

雷公山國家級自然保護區(qū)位于26°15′～26°32′N，108°5′～108°24′E，屬貴州東南部的雷山縣，總面積47 792 hm2，最高峰海拔為2 178.8 m，氣候類型多樣，生物資源豐富，海拔1 300 m為常綠闊葉林，氣候溫暖濕潤，多為黃壤，土壤肥力高，樹種組成復雜，具有豐富的植物種類；海拔1 300～2 100 m為常綠落葉混交林，氣候濕潤清涼，多為黃棕壤，植被中常綠成分減少；海拔2 100 m以上為高山灌叢，年平均氣溫低，風大，土層較薄，為草甸土，植物種類較少，常見大白杜鵑、箭竹等。

2 材料和方法

2.1 材 料

實驗樣品于2018—2019年6—8月在雷公山自然保護區(qū)的四類優(yōu)勢林分（常綠闊葉林、落葉闊葉林、針葉林、灌叢）中分別設置5個樣地，每一樣地中采用隨機取樣法，在樣樹周圍挖取深度20 cm左右?guī)「耐翗印?/p>

2.2 方 法

2.2.1 形態(tài)分類學的鑒定

將土樣置于雙蒸水中浸泡，挑出斷根后洗凈，剪短，體式顯微鏡下挑出菌根，并依據(jù)菌根的顏色、分支類型、表面性狀、外延菌絲等形態(tài)特征進行分類，每一類型保存兩份。一份采用FAA固定液保存，對其外部形態(tài)特征進行描述，并剝離菌套，制成臨時玻片，對顯微結構進行觀察描述。菌根的外部形態(tài)采用Olympus體視顯微鏡在10×4倍條件下觀察。菌根菌絲及剝離菌套的內、外表面解剖結構均采用Olympus生物顯微鏡分別在10×40倍條件與10×100倍條件下觀察。另一份采用CTAB緩沖液保存。

2.2.2 分子生物學的鑒定及分析

1）PCR擴增

將保存于CTAB緩沖液中的菌根挑取2～3個根尖，采用CTAB法提取總DNA，以ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA） 和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物進行PCR，PCR后得到的擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測后，采用DNA試劑盒回收擴增的條帶，進行純化后送生物工程公司直接測序。

2）系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Blast軟件，對所測ITS區(qū)段DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫Genbank中搜索同源序列，進行比較分析并采用Mega7.0軟件，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

3 結果與分析

3.1 形態(tài)學及解剖學特征

T1菌根系統(tǒng)多不分支，或為單軸，極少數(shù)二叉分支，分支為1～2級，菌根主軸長度為1.1±0.4 cm，菌根直徑為0.2±0.05 cm，其顏色為淡黃色至黃色之間，菌根末端未分支的部位多呈棒狀、念珠狀，菌根由基部至頂部依次變小，呈三角形，菌根表皮光滑，菌根僅有極少量稀疏纏繞在未分支末端的外延菌絲，且較短，無根狀菌索，無囊狀體，無菌核（圖1A—B）。外層菌套的菌套類型為M型，內表面菌絲平行排列，細胞壁薄，內層菌套為H型，基部細胞的細胞壁稍厚，其他細胞的細胞壁薄，菌絲有隔無鎖狀聯(lián)合，由菌絲套延伸出（圖1E—F）。

T2菌根系統(tǒng)為二叉分支，分支1～2級，菌根的末端尖狀，主軸長2.1±0.3 cm，直徑為0.1±0.03 cm，菌根顏色為棕褐色至褐色，菌根幼嫩部分顏色淺，發(fā)亮，菌根末端存在極少量稀疏的外延菌絲，外延菌絲呈絨毛狀，無根狀菌索，無囊狀體，無菌核（圖2A—B）。外層菌套的菌套類型為Q型，菌絲細胞排列整齊，細胞壁較薄，內層菌套為E型，菌絲膨大，較多分支，且緊密纏繞彎曲，菌絲有隔無鎖狀聯(lián)合（圖1E—F）。

圖1 T1菌根的外部形態(tài)與解剖結構Fig.1 External morphology and anatomical structure of T1

圖2 T2菌根的外部形態(tài)與解剖結構Fig.2 External morphology and anatomical structure of T2

3.2 PCR擴增

對供試菌根中均提取的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測為單一的清晰條帶，所得樣品濃度大于100 μg/mL，采用紫外分光光度檢測法得出OD260/OD280＞1.7，由此可知：該實驗中所提取到的基因組DNA可滿足后續(xù)實驗的要求。進一步進行PCR擴增，PCR中采用的模板為上步實驗提取的基因組DNA，引物為真菌特異性序列ITS區(qū)段的ITS1F、ITS4，進行PCR擴增實驗得樣品的ITS區(qū)段部分序列，所得序列經(jīng)凝膠電泳檢測得知PCR產(chǎn)物片段大小均在700 bp左右，與實驗預期所需得到的片段大小基本一致，即可回收測序。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹結果分析

運用Genbank中的BLAST，引用NCBI數(shù)據(jù)庫中隸屬于塊菌屬Tuber的ITS區(qū)段序列，即印度塊菌T.indicum序列4個，喜馬拉雅塊菌T.himalayense序列1個，黑孢塊菌T.melanosporum序列3個，劉氏塊菌T.liui序列1個，中甸塊菌T.zhongdianense序列2個，夏塊菌T.aestivum序列3個，冬塊菌T.brumale序列2個。對PCR經(jīng)測序后所獲得序列進行規(guī)范性修改，外類群的確定用Mega7.0進行序列對比與排序，得系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構，結果如圖3所示。

由此進化樹分析可知：目標序列T1、T2均與印度塊菌聚在一枝，但T1與印度塊菌、黑孢塊菌、夏塊菌、冬塊菌4種類型的塊菌序列聚成一枝，且支持率高，為96%。中甸塊菌與劉氏塊菌另聚成一枝，二者支持率為80%，其中印度塊菌與喜馬拉雅塊菌聚為一枝，支持率為90%，喜馬拉雅塊菌、印度塊菌作為一組與黑孢塊菌聚為一個亞枝，支持率為94%，由此可知劉氏塊菌與中甸塊菌的親緣關系較近；喜馬拉雅塊菌與印度塊菌的親緣關系較近，喜馬拉雅塊菌與印度塊菌、黑孢塊菌在遺傳關系上比較相近。

圖3 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

目標序列T1以96%的支持率與印度塊菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一亞支，證明目標序列T1為印度塊菌所形成的外生菌根真菌，目標序列T2與印度塊菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中雖然聚為一支，但支持率較低，僅為60%，初步確定目標序列T2為塊菌屬的一個種，與印度塊菌有較近的親緣關系。

4 結論與討論

本研究對貴州雷公山所采集的T1、T2外生菌根進行形態(tài)學與分子生物學研究后得出結論：這2種外生菌根均為塊菌屬外生菌根，T1為印度塊菌屬外生菌根，T2為塊菌屬的一種。

本研究對所采集的菌根樣品經(jīng)形態(tài)學分類后再進行分子生物學鑒定，樣品T1、T2與塊菌屬序列比對并構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，得出二者為塊菌屬外生菌根真菌，由系統(tǒng)發(fā)育樹上分析：樣品T1、T2二者與印度塊菌具有較近的親緣關系，樣品T1與印度塊菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上支持率極高，達96%，形態(tài)學特征上，T1菌根顏色較淺，分支較少，外延菌絲少而且稀疏，菌絲細胞的細胞壁薄等特征均與之前報道的白樺、樟子松[12-13]上所采集的印度塊菌菌根的形態(tài)結構相似，由此可確定T1為印度塊菌菌根。T2與印度塊菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中雖然聚為一支，但支持率較低，僅為60%。

T2菌根多二叉分支，顏色略深，菌絲緊密纏繞，彎曲，這些形態(tài)學上的特征與所報道的印度塊菌菌根的形態(tài)結構略有不同，由此只能確定為塊菌屬的一種菌根，與印度塊菌有較近的親緣關系，具體為哪一個種還需要進一步研究論證。

塊菌屬真菌資源的調查多依賴于對子實體的采集鑒定，但子實體的產(chǎn)生與外界環(huán)境因素有較大的關系，在未發(fā)現(xiàn)子實體的區(qū)域是否有塊菌屬菌根真菌資源存在。依據(jù)新近報道，我國擁有豐富的塊菌屬菌根資源，且有其不同于國外塊菌屬菌根的獨特特征，目前尚存在大量未被發(fā)現(xiàn)的塊菌屬外生菌根的新分類群[14-17]，是否可以通過采集菌根后，對其形態(tài)學與分子生物學相結合的方法進行調查研究，對未形成子實體的塊菌屬真菌資源進行調查，此類研究還有待進一步開展。

由本研究得知，雷公山國家自然保護區(qū)存在塊菌屬外生菌根真菌，但多年的調查研究均未采集到子實體，該地區(qū)哪些地理環(huán)境因素限制了塊菌子實體的產(chǎn)生還有待進一步的研究