楊建新 金華 朱振秀 俞麗 高永平 金萬昆 田穎剛

摘?要：津新烏鯽（Carassiusauratus var.Jinxin Black）是具有較高營養(yǎng)和食用價值的鯽魚新品種，為分析其肌肉中的小肽及其結(jié)構(gòu)，建立了電噴霧-串聯(lián)四級桿-飛行質(zhì)譜分析津新烏鯽中的一種二肽Tyr-Ser的方法，優(yōu)化了津新烏鯽提取物的色譜分離條件。采用Agilent Zorbax Rx-C8柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（V∶V=2∶98），0.8 mL/min等度洗脫，采用ESI-QTOF對其中一種二肽進行鑒定，證實二肽為Tyr-Ser。

關(guān)鍵詞：津新烏鯽（Carassiusauratus var.Jinxin Black）;高效液相;電噴霧質(zhì)譜;二肽

在現(xiàn)代科學(xué)研究中，質(zhì)譜分析技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和發(fā)展，在蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽的研究中，質(zhì)譜分析已成為鑒定蛋白質(zhì)和多肽類的重要手段[1]。目前在分析中常用的有基質(zhì)輔助解吸電離-飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF）、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ESI-MS/MS）和離子阱質(zhì)譜法（IT-MS）[2]。ESI-QTOF是在電噴霧質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上，采用雙重四級桿與飛行時間質(zhì)量分析器串聯(lián)，具有較好的分辨率和靈敏度[3]。ESI-TOF-MS不僅可以在離子傳輸區(qū)域進行碰撞誘導(dǎo)解離，還可以在源后衰變時提供分子的結(jié)構(gòu)信息。因此，TOF-MS與ESI-MS聯(lián)用技術(shù)在生物大分子研究中具有廣闊的前景。TOF-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)及其多肽的研究中具有可鑒定蛋白質(zhì)功能﹑研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用﹑比較蛋白質(zhì)組的表達差異﹑研究蛋白磷酸化和糖基化等功能[4-6]。

津新烏鯽（Carassiusauratus var.Jinxin Black）是天津市換新水產(chǎn)良種場以白化紅鯽（Carassius auratus，white type）和墨龍鯉（Cyprinus carpio var. Molong）為原始育種親本，通過雜交育種技術(shù)育成的國內(nèi)首個集觀賞與食用為一體的全黑體色鯽魚新品種（登記號：GS-02-002-2013）[7]。已有研究證明津新烏鯽魚體中含有較高含量的多不飽和脂肪酸;魚體中的氨基酸總量和必需氨基酸含量明顯高于鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鯉（Cyprinus carpio）和鯽（Carassius auratus auratu）等常見養(yǎng)殖魚類。這說明津新烏鯽是一種具有較高營養(yǎng)和食用價值的優(yōu)良養(yǎng)殖品種[8]。本實驗采用了液相分離和電噴霧-串聯(lián)四級桿-飛行質(zhì)譜分析法，對津新烏鯽提取物中的小肽進行了分析鑒定，方法簡便、快速，所建立的方法對于津新烏鯽提取物的分析和結(jié)構(gòu)鑒定具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?樣品制備

試驗材料為津新烏鯽，取自天津市換新水產(chǎn)良種場，體重900～1 200 g。稱取津新烏鯽18尾，放血處死，去魚鱗、內(nèi)臟、魚頭，洗凈，用組織搗碎機絞碎，準(zhǔn)確稱取津新烏鯽的肉泥2 g，加入約6 mL的提取液（5%乙腈-95%甲酸溶液（0.1%甲酸）），置于離心管中于室溫下超聲萃取1 h（頻率：40 kHz，功率：50 W），10 000 r/min離心10 min，收取上清液。取3 mL上清液加入體積分數(shù)2%三氟乙酸，10 000 r/min離心5 min。取上清液200 μL，用色譜級的超純水稀釋至約1.5 mL，稀釋后的液體用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液置于4 ℃保存。實驗做三組平行樣。

1.2?儀器與試劑

安捷倫1290系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，南昌大學(xué)國家重點實驗室公共實驗平臺），6538UHD三重四級桿飛行質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司，南昌大學(xué)國家重點實驗室公共實驗平臺），安捷倫色譜柱Agilent Zorbax Rx-C8（4.6 mm×250 mm，5 μm），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國 MLlipore公司），XB電子分析天平（Precise瑞士），AnkeTGL-16C;離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），KQ3200E超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

乙腈（HPLC，美國新天地），三氟乙酸（HPLC，阿拉?。姿幔ˋR，國藥），有機濾頭（0.22 μm）。水為HPLC級的超純水。

1.3?液相及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Rx-C8（4.6 mm×250 mm），流動相：2%乙腈-98%甲酸溶液（甲酸0.1%），0.8 mL/mL等度洗脫，DAD進行190～400 nm掃描。

質(zhì)譜分析條件：

離子源：ESI源;離子模式：正離子;干燥氣溫度：350 ℃;干燥氣流速：10 L/min;霧化氣壓力：40 psi;掃描范圍：m/z 50～1 000;毛細管出口電壓：80～150 V;錐孔電壓：50 V;二級MS碰撞能10～40 V。實驗數(shù)據(jù)采用Agilent Mass Hunter Workstation軟件處理。

1.4?分析方法

采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相，對不同體積分數(shù)的乙腈進行了篩選。分別采用20%乙腈-80%甲酸溶液、10%乙腈-90%甲酸溶液、5%乙腈-95%甲酸溶液、2%乙腈-98%甲酸溶液等進行流動相的選擇。

選擇合適的流動相后，采用電噴霧-串聯(lián)四級桿-飛行質(zhì)譜，首先用TOF-MS模式進行全掃描分析，通過改變毛細管出口電壓80～150 V，得到二肽的[M+H]+或[M+2H]2+準(zhǔn)分子離子峰后，再利用正離子離子掃描模式對[M+H]+進行MS/MS分析[9]。二級MS碰撞能10～35 V。

2?結(jié)果與討論

2.1?液相洗脫條件選擇、優(yōu)化結(jié)果

應(yīng)用RP-HPLC分離蛋白質(zhì)和肽，通常在流動相中加入酸性抑制劑，以調(diào)節(jié)流動性的pH值，改善峰的峰形和分離度。本實驗加入0.1%甲酸，有利于分離，且在電噴霧質(zhì)譜中可以優(yōu)化電離。在0.1%甲酸的條件下進行等度洗脫，比較了乙腈體積分數(shù)分別為20%、10%、5%及2%的分離情況（見圖1）。結(jié)果表明，采用20%和10%乙腈作為流動相時，各個峰不能得到很好的分離（見圖1a、b），以5%乙腈作為流動相時，各個峰基本實現(xiàn)分離，但是各個峰分布較為緊密，不利于電噴霧質(zhì)譜上對峰進行鑒定與分析（見圖1c），而用2%乙腈洗脫時，各組分能實現(xiàn)很好的分離，且保留時間適中（見圖1d），可用于電噴霧質(zhì)譜上對各個峰進行分析與歸屬。

2.2?色譜峰的歸屬結(jié)果

津新烏鯽樣品質(zhì)譜的總離子流圖及高效液相的色譜圖見圖2。利用電噴霧—串聯(lián)四級桿—飛行質(zhì)譜對液相分離的組分進行結(jié)構(gòu)鑒定，在正離子模式下，由圖3可知二肽的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 269.088 2，[M+H]+，即二肽的分子量M為268.080 4，m/z 291.069 9是[M+Na]+，m/z 559.150 3為[2M+Na]+，其中m/z 137.045 8為[Tyr-COOH+H]+，m/z 269.088 2與m/z 137.045 8之差132.042 4為Ser氨基脫氫連接肽鍵的部分加上一個H+。為進一步確定結(jié)構(gòu)，再利用正離子離子掃描模式對[M+H]+進行MS/MS分析。

通過調(diào)節(jié)二級MS碰撞能10～40 V，對m/z 269.087 7和m/z 137.045 8進行分析，獲得一系列MS/MS圖，分析可知其中m/z 137.045為[Tyr-COOH+H]+，列舉其中圖4，其中m/z 94.039 7為[C6H5O+H]+，為二肽中Tyr部分中苯羥基斷裂后加H+，m/z 110.034 8為[C7H7+H2O+H]+，為Tyr中烷基苯加水加H+，m/z 119.036 3為[C8H8N+H]+，即為Tyr部分失去-COOH后脫一分子水后加H+，[Tyr-COOH-H2O+H]+。

對m/z 269.087 5進行二級MS分析，列舉如圖5，分析可知m/z 60.044 9為[C2H5NO+H]+，即為二肽肽鍵中間斷裂，Ser部分再失去-COOH后加H+，即[Ser-COOH-H+H]+，m/z 94.041 5為 [C6H5O+H]+，m/z 137.045 8為[Tyr-COOH+H]+。對一系列由二級MS碰撞能10～40 V獲得的MS/MS片段見表1。

通過ESI-QTOF對津新烏鯽中的二肽分析為Tyr-Ser，分子式為C12H16O5N2，分子量為268.105 5，結(jié)構(gòu)式見圖6。

2.3?討論

本研究中采用反相色譜法對津新烏鯽肌肉中的小肽進行了分離，并采用ESI-QTOF質(zhì)譜對津新烏鯽中二肽進行了一級結(jié)構(gòu)鑒定及MS/MS分析，通過改變毛細管出口電壓，得到二肽準(zhǔn)分子離子峰后，再選擇適當(dāng)?shù)亩壟鲎材芰?，利用正離子離子掃描模式對二肽進行MS/MS分析，進而確定了其結(jié)構(gòu)。目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域研究中，質(zhì)譜已成為鑒定蛋白質(zhì)及多肽的最重要技術(shù)平臺之一。韓超等采用ESI-TOF/MS分析了太子參中的環(huán)肽類化合物，通過電噴霧-飛行時間質(zhì)譜獲得了化合物的準(zhǔn)確分子量信息，并對結(jié)構(gòu)進行了鑒定[10]。周紅華等應(yīng)用ESI-MS及源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)對肽類藥物曲普瑞林及促黃體素釋放激素類似物進行測定，確證了其氨基酸序列和分子量以及寡肽的一級結(jié)構(gòu)[11]。陳瑤函等對質(zhì)譜軟電離技術(shù)在完整糖肽分析中的應(yīng)用進行了研究，通過MALDI-MS/MS和ESI-MS/MS對目標(biāo)糖蛋白進行分析，獲得了糖肽的糖鏈結(jié)構(gòu)信息[12]。結(jié)合本次實驗結(jié)果表明電噴霧-飛行時間質(zhì)譜為多肽類化合物分子量及一級結(jié)構(gòu)的確證，提供一種高效準(zhǔn)確、靈敏快速的手段。

已有研究證明津新烏鯽中含有較高含量的多不飽和脂肪酸，并且津新烏鯽中的氨基酸總量和必需氨基酸含量明顯高于鰱、草魚、鯉和鯽等常見養(yǎng)殖魚類，證實津新烏鯽是一種具有較高食用價值和保健作用的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，具有廣闊的開發(fā)前景[8]。本次實驗首次對津新烏鯽中的小肽進行了液相分離和電噴霧-串聯(lián)四級桿-飛行質(zhì)譜分析，證實了小肽結(jié)構(gòu)為Tyr-Ser。韓國專利表明Tyr-Ser是一種具有美白功能的二肽，其分子量較小，對細胞的通透性較好，在化妝品產(chǎn)品中具有開發(fā)前景[13]。本次研究將為津新烏鯽的營養(yǎng)價值及商品開發(fā)價值提供理論基礎(chǔ)。

致謝：本實驗得到南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室趙溪雁、?？∏洹⒘未浩G同學(xué)的大力幫助，特此致謝！

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（收稿日期：2020-07-20;修回日期：2020-08-23）