朱程程，馬大君，程占軍，曹錦和，孫勇，萬(wàn)寧，李翔

(公安部南京警犬研究所/警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210012)

隨著我國(guó)警犬技術(shù)的快速發(fā)展，警犬的使用范圍從過(guò)去的刑事偵查、維護(hù)治安擴(kuò)展到血跡搜索、搜毒搜爆、安檢和消防搜救等領(lǐng)域，而史賓格犬由于興奮性高、體型小、嗅覺(jué)靈敏、耐力持久等特點(diǎn)，在這些新興領(lǐng)域的使用中發(fā)揮著不可替代的作用。但是在膽量方面，史賓格犬的膽量天生較小，容易表現(xiàn)出恐懼行為，以至于部分史賓格犬不能被訓(xùn)練成工作犬投入到實(shí)戰(zhàn)工作中去。

犬的恐懼行為與遺傳、環(huán)境、表觀因子等多種因素有關(guān)，欲想提高犬的膽量，降低恐懼行為，可以通過(guò)傳統(tǒng)育種和分子育種2種方法。雖然通過(guò)傳統(tǒng)育種方法可以在一定程度上提高膽量，但是傳統(tǒng)育種方法具有周期長(zhǎng)，且一旦品種育成就不易引入其他新的遺傳性狀等缺點(diǎn)。而隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子育種顯示出越來(lái)越強(qiáng)大的生命力，逐漸成為動(dòng)物育種的趨勢(shì)和主流。降低犬天生的恐懼行為，就要尋找與犬膽量性狀相關(guān)的基因，探索犬膽量性狀遺傳機(jī)理，這能為從分子水平上對(duì)史賓格犬膽量性狀進(jìn)行遺傳改良提供理論依據(jù)。

基因組遺傳變異形式主要有單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)、插入缺失(insertion-deletion, InDel)等，對(duì)基因組內(nèi)遺傳變異的發(fā)掘和研究是開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記和功能基因定位的基礎(chǔ)。SNP是最常見(jiàn)的遺傳變異形式，約占全部變異的90%左右，各物種內(nèi)都已經(jīng)鑒定出海量的SNP，這些SNP被廣泛用于基因遺傳定位和群體進(jìn)化研究。InDel是基因組中數(shù)量?jī)H次于SNP的第二大類遺傳變異，如果按照總長(zhǎng)度計(jì)算，InDel甚至和SNP相當(dāng)。

目前對(duì)于恐懼行為方面的研究主要集中在小鼠上。有研究表明，終紋床核和內(nèi)側(cè)杏仁核都是與嚙齒類動(dòng)物天生恐懼行為相關(guān)的大腦區(qū)域，抑制大腦這2個(gè)區(qū)域的活動(dòng)能夠減少嚙齒類動(dòng)物天生的懼怕感[1]。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)是一類可被胞外H+激活的非選擇性陽(yáng)離子通道，ASIC1a參與突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶及條件性恐懼情緒等生理過(guò)程[1]。過(guò)表達(dá)ASIC1基因會(huì)使小鼠條件性恐懼行為增強(qiáng)[2]。另一方面，ASIC1a在小鼠天生恐懼感的形成等過(guò)程中，同樣發(fā)揮重要作用[3]。Zhu等[4]研究證明，杏仁核EphB2信號(hào)調(diào)控小鼠先天性恐懼行為。Shumyatsky等[5]研究報(bào)道，敲除小鼠微管解聚蛋白(stathmin)基因后，會(huì)顯著減少先天性恐懼行為。

分離群體混合分析是基因定位的有效手段之一。20世紀(jì)末，研究人員將具有多態(tài)性的分子標(biāo)記與極端表型材料的DNA混池結(jié)合，能夠成功鑒定與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)[6-7]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員將分離群體混合分析與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)混池測(cè)序方法，目前該方法已在水稻[8]、大豆[9]等作物以及雞[10]、奶牛[11]等畜禽中得到廣泛應(yīng)用。然而，混池測(cè)序在動(dòng)物行為相關(guān)基因挖掘方面的研究較少，在犬恐懼行為相關(guān)變異位點(diǎn)和基因的挖掘方面未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用了混池測(cè)序方法對(duì)犬全基因組與恐懼行為相關(guān)的SNP和InDel進(jìn)行篩選，以期發(fā)掘與犬恐懼行為相關(guān)的功能基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

本研究所用犬由公安部南京警犬研究所提供。對(duì)6～8月齡的犬進(jìn)行嚴(yán)格的恐懼行為測(cè)試，根據(jù)測(cè)試結(jié)果選取恐懼行為極端差異的史賓格犬20條。采用前肢靜脈采血的方法，將采集的全血收集在含有EDTA抗凝血的采血管中，處理后保存至-80 ℃的冰箱。

1.2 方法

1.2.1 恐懼行為測(cè)試

恐懼行為測(cè)試包括5個(gè)項(xiàng)目，陌生人測(cè)試、光滑地面和槍聲測(cè)試[12]、雨傘測(cè)試和金屬易拉罐測(cè)試[13]。具體參考文獻(xiàn)[14]的研究方法。

1.2.2 DNA提取及檢測(cè)

使用Solarbio全血基因組DNA提取試劑盒從采集的犬全血中提取全基因組總DNA，依照說(shuō)明書的要求及步驟提取血樣DNA。通過(guò)Nanodrop檢測(cè)DNA純度，OD260/280比值在1.6至1.8之間。利用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)提取的DNA進(jìn)行電泳，電壓為150 V，電泳時(shí)間為30 min，分析DNA質(zhì)量。通過(guò)Qubit 2.0檢測(cè)樣品濃度。

1.2.3 樣品DNA分組混池

將采集的恐懼行為極端差異的20頭犬分為2組，其中恐懼行為極高的10頭設(shè)為高恐懼組(terrified group, FBH)組，恐懼行為極低的10頭為低恐懼組(slight fear group, FBL)組，并將2組群體的基因組DNA分別等量混合。

1.2.4 DNA池重測(cè)序篩選SNPs和InDels

DNA提取、檢測(cè)和混池結(jié)束后，送至奧維森基因科技有限公司，公司質(zhì)量檢測(cè)合格后，構(gòu)建插入片段為200 bp的測(cè)序文庫(kù)，再進(jìn)行文庫(kù)檢測(cè)。文庫(kù)質(zhì)檢合格后，選擇Hiseq TM 2500測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

1.2.5.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

本研究使用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，分別查看單堿基測(cè)序質(zhì)量分布、測(cè)序錯(cuò)誤率分布和序列GC含量分布等方面的信息，若某評(píng)估項(xiàng)目不合格，需要依據(jù)情況進(jìn)行過(guò)濾，直到評(píng)估合格后進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.2.5.2 序列比對(duì)參考基因組

本研究使用BWA把有效測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，然后用SAMtools[15]來(lái)檢測(cè)SNP，只保留測(cè)序產(chǎn)生的短序列(reads)支持?jǐn)?shù)大于等于4，比對(duì)質(zhì)量值≥20的結(jié)果，且過(guò)濾Gap附近5 bp范圍內(nèi)的SNP，過(guò)濾SNP位點(diǎn)鏈偏向性(Pvalue<10-4)。本研究利用ANNOVAR軟件[16]對(duì)SNP和InDel進(jìn)行注釋分析。

1.2.5.3 與史賓格犬恐懼行為相關(guān)SNP和InDel位點(diǎn)挖掘

由DNA混池全基因組重測(cè)序技術(shù)可得到大量SNPs和InDels，為保證準(zhǔn)確性，將對(duì)篩選出的SNPs和InDels進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。篩選條件[11]為排除FBH組和FBL組相同SNPs和InDels；SNPs和InDels位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域；SNPs和InDels位點(diǎn)變異類型選取非同義突變；1個(gè)基因出現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)變異的SNPs和InDels；樣本基因型為雜合變異；測(cè)序深度大于40，測(cè)序深度越深，變異位點(diǎn)準(zhǔn)確性越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 20條史賓格犬基因組DNA檢測(cè)

20條史賓格犬基因組DNA檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，由圖可知犬基因組DNA長(zhǎng)度為21 kb。條帶亮度尚可，基因組DNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

M1、M2.DNA Marker；1～20.第1～20號(hào)犬的基因組DNA

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

根據(jù)公司提供的數(shù)據(jù)資料，使用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，結(jié)果表明，2組測(cè)序數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量值均在Q30～40之間，測(cè)序數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率在0.1%以下。FBH和FBL2組的AT，GC含量，基本上處于接近狀態(tài)。測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后，F(xiàn)BH組可用reads數(shù)為95.68%，F(xiàn)BL組可用reads數(shù)為95.16%。所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測(cè)序質(zhì)量合格，GC分布正常，建庫(kù)成功。

2.3 基因組比對(duì)分析

將樣本序列與參考基因組序列進(jìn)行相似性比對(duì)，覆蓋深度和覆蓋度可以直接反應(yīng)測(cè)序數(shù)據(jù)的均一性及參考序列的同源性。

由表1可知，2組樣本的比對(duì)率為100%，對(duì)參考基因組的平均覆蓋深度分別為10.06X和12.67X，1X覆蓋度在99.58%和99.63%。由此可知，reads與參考序列比對(duì)結(jié)果正常，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

表1 測(cè)序深度及覆蓋度統(tǒng)計(jì)

2.4 SNP檢測(cè)

由表2可知，F(xiàn)BH組外顯子區(qū)域發(fā)生突變位點(diǎn)31 226個(gè)，其中非同義突變13 232個(gè)。FBL組外顯子區(qū)域發(fā)生突變32 698個(gè)，其中非同義突變13 808個(gè)。

表2 SNP檢測(cè)和注釋結(jié)果

2.5 InDel檢測(cè)

由表3可知，F(xiàn)BH組外顯子區(qū)域InDel位點(diǎn)共有1 697個(gè)，F(xiàn)BL組外顯子區(qū)域InDel位點(diǎn)共有1 794個(gè)。

表3 InDel檢測(cè)和注釋結(jié)果

2.6 SNP和InDel篩選

根據(jù)SNP和InDel篩選條件篩選出以下SNP和InDel位點(diǎn)。具體信息見(jiàn)表4和表5。通過(guò)1.2.5.3中篩選條件，共篩選出14個(gè)SNP位點(diǎn)，2個(gè)InDel位點(diǎn)，這16個(gè)位點(diǎn)位于9個(gè)基因上。

表4 SNP信息

表5 InDel 信息

3 討論

3.1 混池測(cè)序數(shù)據(jù)的影響因素

混池測(cè)序結(jié)果的分析對(duì)犬恐懼行為相關(guān)變異位點(diǎn)的篩選至關(guān)重要，其影響因素也較多。犬恐懼行為強(qiáng)弱的精準(zhǔn)判斷是混池測(cè)序的基本要求，若判斷不準(zhǔn)確，則會(huì)影響混池測(cè)序的分析結(jié)果。此外，測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出過(guò)程中文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)檢等每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生影響，而高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)是得到可靠分析結(jié)果的必要保障。因此，在混池測(cè)序數(shù)據(jù)分析之前，應(yīng)首先根據(jù)一定的篩選條件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，并且對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，若評(píng)估出現(xiàn)問(wèn)題，則應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)處理。

3.2 SNP和InDel位點(diǎn)的篩選

SNP選擇時(shí)是根據(jù)特定的條件進(jìn)行的篩選，主要考慮的是非同義突變。非同義突變是指DNA鏈上的堿基發(fā)生改變會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列的改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變化。非同義突變會(huì)導(dǎo)致蛋白功能發(fā)生變化。而同義突變的堿基并不會(huì)引起氨基酸的變化，從而也不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能，因此，篩選會(huì)導(dǎo)致非同義突變的SNPs意義更大，非同義突變的SNPs是首要選擇。

雖然目前的高通量測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確度相對(duì)較高，但仍存在一定程度的測(cè)序錯(cuò)誤[17]。因此，在篩選測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果的時(shí)候需要選擇合適的測(cè)序深度的數(shù)據(jù)。本研究選擇測(cè)序深度大于等于40的SNP和InDel位點(diǎn)，與李金霞[11]在篩選中國(guó)荷斯坦奶牛SNPs位點(diǎn)的測(cè)序深度篩選條件相一致。

3.3 突變位點(diǎn)所在基因的相關(guān)研究

本研究通過(guò)混池測(cè)序的方法篩選出的14個(gè)SNP位點(diǎn)和2個(gè)InDel位點(diǎn)中，大部分突變位點(diǎn)位于新基因上，其中有2個(gè)SNP位點(diǎn)位于MUC6基因上。MUC6是一種編碼黏蛋白的基因，腫瘤組織中MUC6多出現(xiàn)異常表達(dá)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病與MUC6基因的遺傳多態(tài)性相關(guān)[19]。本研究結(jié)果表明，MUC6基因上有2個(gè)SNP位點(diǎn)與犬恐懼行為相關(guān)，關(guān)于MUC6基因?qū)θ謶中袨榈挠绊懶枳鲞M(jìn)一步的驗(yàn)證。

近年來(lái)，人們主要采用芯片雜交技術(shù)篩選犬特定性狀和疾病差異表達(dá)基因[20-22]，很少利用混池測(cè)序的方法來(lái)篩選犬特定性狀相關(guān)變異位點(diǎn)。本研究利用DNA混池測(cè)序的方法分析恐懼行為極端差異史賓格犬的差異變異位點(diǎn)，共獲得14個(gè)SNP位點(diǎn)和2個(gè)InDel位點(diǎn)，由于DNA混池測(cè)序的樣本量每組只有10個(gè)，樣本量較少，試驗(yàn)結(jié)果可能不具備足夠的說(shuō)服力。因此，關(guān)于篩選位點(diǎn)對(duì)犬恐懼行為的影響還需要深入研究，并通過(guò)擴(kuò)大群體進(jìn)行驗(yàn)證，以確定與犬恐懼行為遺傳效應(yīng)相關(guān)的SNPs，為犬遺傳育種改良提供理論依據(jù)。