曹潔，劉萌，陳雨晴，閆麗萍

(教育部動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際聯(lián)合試驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物免疫工程試驗(yàn)室/江蘇省陸生野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)中心/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫研究所/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要病毒之一，依據(jù)不同的抗原結(jié)構(gòu)可將FAdV分成3個(gè)群，其中Ⅰ群FAdV根據(jù)其結(jié)構(gòu)中L1～L4 4個(gè)高變環(huán)的特點(diǎn)和限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度不同可分成5個(gè)基因型(A～E)，通過(guò)血清中和試驗(yàn)可將其劃為12個(gè)血清型(1～7、8a、8b、9～11)[1]。FAdV自1987年在巴基斯坦首次報(bào)道[2]，隨后蔓延至墨西哥、俄羅斯、日本、韓國(guó)、印度、智利、伊拉克、孟加拉國(guó)和南美洲等多個(gè)國(guó)家[3-10]。2012年，韓國(guó)Choi等[7]發(fā)現(xiàn)FAdV在雞群中暴發(fā)，病原檢測(cè)主要為FAdV血清4型(FAdV-4)和血清8型(FAdV-8)，此外大部分發(fā)病雞伴隨其他免疫抑制性疾病。2013年，Kajan等[11]報(bào)道了匈牙利東部地區(qū)暴發(fā)以FAdV-D和FAdV-E為主，并伴隨FAdV-B感染的FAdV病，發(fā)病雞群的特征癥狀主要表現(xiàn)為沙囊糜爛和包涵體肝炎。2015年Zhao等[12]通過(guò)病毒的分離鑒定，從患有包涵體肝炎和心包積液綜合征的病雞組織中檢測(cè)出FAdV-C和FAdV-D，這是有關(guān)FAdV在中國(guó)地區(qū)內(nèi)流行與傳播擴(kuò)散的首次報(bào)道。2015年以來(lái)，F(xiàn)AdV-4因其發(fā)病率高且既可水平傳播又可垂直傳播的特點(diǎn)，在中國(guó)地區(qū)內(nèi)擴(kuò)散迅猛并大范圍流行[13]。病雞主要表現(xiàn)為心包淡黃色積液、肝臟腫脹、肺臟水腫并伴有尿酸鹽沉積等癥狀，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[14]。

FAdV是二十面體對(duì)稱(chēng)的無(wú)囊膜雙鏈DNA病毒，基因組總長(zhǎng)度約為45 kb，病毒衣殼主要由3種結(jié)構(gòu)蛋白包括六鄰體蛋白(Hexon)、纖突蛋白(Fiber)和五鄰體蛋白(Penton base)構(gòu)成。其中Hexon蛋白是含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，與病毒的免疫原性密切相關(guān)；Penton base蛋白分布于每個(gè)二十面體的頂端，具有類(lèi)似毒素的活性，可引起宿主細(xì)胞的細(xì)胞病變現(xiàn)象，在病原體入侵的全過(guò)程具有極為重要的功能[15]；Fiber蛋白可分為 Fiber 1和Fiber 2，它與病毒中和、細(xì)胞受體結(jié)合、組織趨向性和毒力的變化有關(guān)，F(xiàn)iber 1和Fiber 2蛋白與Penton base相連伸出[16-17]。Fiber的長(zhǎng)短不一，可直接調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞表面具有識(shí)別和黏附細(xì)胞外基質(zhì)功能的整聯(lián)蛋白對(duì)病毒與細(xì)胞相結(jié)合的過(guò)程，在病原體侵入宿主細(xì)胞及與相關(guān)特異性蛋白結(jié)合等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的調(diào)控功能。目前國(guó)內(nèi)研究工作多為針對(duì)FAdV的Fiber 2蛋白抗體的制備及檢驗(yàn)方法的建立，缺乏對(duì)Fiber 1相關(guān)抗體的研究。因此，本試驗(yàn)制備了國(guó)內(nèi)C型FAdV-4流行毒株的Fiber 1的多克隆抗體，為研發(fā)FAdV-4相關(guān)診斷試劑及疫苗提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及試驗(yàn)動(dòng)物

FAdV-4、原核表達(dá)載體pCold I、雞肝癌細(xì)胞LMH及大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存；2月齡體重2.5 kg左右的新西蘭大白兔購(gòu)自南京卡文斯生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

XhoⅠ和HindⅢ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase、ClonExpress Ⅱ one step cloning kit均購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、多聚賴(lài)氨酸均購(gòu)自Sigma公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗均購(gòu)自KPL公司；NI-NTA填料購(gòu)自QIAGEN公司；化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液購(gòu)自Biosharp公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清為L(zhǎng)ife Technologies公司產(chǎn)品；病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自南京擎科生物有限公司；引物合成以及測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 pCold Ⅰ-Fiber 1原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)純化

收集病毒培養(yǎng)液上清，用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，作為FAdV-4 Fiber 1基因的擴(kuò)增模板。從NCBI上下載FAdV-4 Fiber 1基因全長(zhǎng)，并用Primers 5.0軟件根據(jù)參考序列(GeneBank登錄號(hào):MF595801)設(shè)計(jì)特異性引物，F(xiàn):5′-CATATGGAGCTCGGTACCctcgagATGTCGGCCCTAAT-CGCCTCCGCAG-3′(小寫(xiě)字母為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，R:5′-AGACTGCAGGTCGACaagcttTTAGGGGCCCGG-AGCATTGTTC-3′(小寫(xiě)字母為HindⅢ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增得到含同源臂的PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)1 341 bp。用同源重組酶將PCR產(chǎn)物與XhoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)雙酶切后的pColdⅠ載體連接，繼而轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。涂布于氨芐固體培養(yǎng)基37 ℃ 溫箱過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選單克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)然后采用菌液PCR鑒定和測(cè)序分析，得到重組陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為pCold Ⅰ-Fiber 1。將陽(yáng)性菌接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)約2 h至菌液呈云霧狀，用1 mmol/L IPTG 16 ℃ 過(guò)夜誘導(dǎo)或37 ℃ 誘導(dǎo)4 h。然后將培養(yǎng)液12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min，用少量PBS吹打重懸菌體，而后進(jìn)行超聲破碎，離心取上清和沉淀。用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白在沉淀和上清中的表達(dá)情況后，取超聲破碎后的包涵體，加入8 mol/L的尿素使其充分溶解，再按照NI-NTA試劑盒說(shuō)明書(shū)將融合蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE方法鑒定純化效果，再將高濃度的純化蛋白儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 Fiber 1多克隆抗體的制備

首次免疫時(shí)，將上述已驗(yàn)證純化效果良好的融合蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合，4 ℃ 環(huán)境中過(guò)夜震蕩使蛋白充分混勻乳化，然后對(duì)2只新西蘭白兔通過(guò)背部皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行第1次免疫(1 mg/只)。初免后每隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用相同方式將弗氏不完全佐劑與純化蛋白混勻，充分乳化后進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射(1 mg/只)，共加強(qiáng)免疫2次。期間檢測(cè)ELISA抗體效價(jià)達(dá)到105以上，即可心臟采血收集血清，作為一抗置于-80 ℃ 保存?zhèn)溆?，若抗體效價(jià)較低可選擇再加強(qiáng)免疫1次。

1.4 ELISA測(cè)定抗體效價(jià)

將純化鑒定好的pCold Ⅰ-Fiber 1蛋白作為包被原，用包被液稀釋至2 μg/mL，100 μL/孔添加至ELISA板中，置于4 ℃ 過(guò)夜或37 ℃ 作用2 h。然后用PBST洗滌3次，拍干酶標(biāo)板后加入5% 脫脂奶37 ℃ 封閉30 min。再用PBST溶液洗3次，將待檢驗(yàn)的兔血清與陰性兔血清分別10倍倍比稀釋加入ELISA板中，100 μL/孔，37 ℃ 孵育1 h后用PBST洗滌3次并拍干，用5% 脫脂奶溶液1∶5 000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(HRP-YKT)并加至ELISA板中，37 ℃作用45 min。孵育結(jié)束后洗滌3次并拍干，避光加入顯色液，100 μL/孔，充分反應(yīng)約10 min后，每孔加入50 μL終止液終止顯色。將終止顯色的ELISA板放入多功能酶標(biāo)儀，測(cè)量OD450。P作為待檢樣品值，N作為陰性對(duì)照值，當(dāng)P/N>2.1時(shí)待檢樣品被判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.5 Western blot鑒定多抗反應(yīng)性

將FAdV-4以感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01接種于LMH細(xì)胞中，接毒36 h后收集細(xì)胞樣品；同時(shí)取pCold Ⅰ與pCold Ⅰ-Fiber 1超聲破碎前全菌以及破碎后的上清和沉淀菌液加入適量4×的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液煮沸10 min。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，按順序加樣(上樣前樣品需1 200 r/min 離心5 min)用80 V電壓電泳40 min，再調(diào)至120 V電壓電泳1 h。然后用半干轉(zhuǎn)法將膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜素上，轉(zhuǎn)印完成后5%脫脂奶常溫封閉1 h,PBST常溫振蕩洗滌3～5次，每次5 min。然后使用1∶1 000倍稀釋的兔抗Fiber 1 的多克隆抗體作為一抗4 ℃ 搖床過(guò)夜孵育膜，5%脫脂奶1∶15 000倍稀釋HRP-YKT作為二抗 37 ℃ 孵育1 h，PBS洗滌3～5次，每次5 min，后用ECL顯色觀察結(jié)果。

1.6 間接免疫熒光檢測(cè)多克隆抗體特異性

將LMH細(xì)胞平鋪于多聚賴(lài)氨酸處理后的96孔培養(yǎng)板上，使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞量約占培養(yǎng)皿的80%時(shí)，用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞3次。再用無(wú)血清培養(yǎng)基將FAdV-4分離株稀釋至每孔接毒量為MOI = 0.01，37 ℃ 吸附1.5 h后，棄掉培養(yǎng)液并用2%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基代替，隨后置于37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。觀察到感染細(xì)胞回縮變圓，發(fā)生明顯且典型的細(xì)胞病變并脫落時(shí)，用4%多聚甲醛溶液常溫固定細(xì)胞15 min；PBS洗滌3次，然后加Fiber 1兔多抗血清或兔陰性血清，用5%脫脂奶按不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)?7 ℃ 孵育1.5 h；PBS洗滌3次，加400倍稀釋FITC 標(biāo)記的羊抗兔 IgG，37 ℃ 孵育45 min；PBS洗3次后，每孔加入50 μL PBS溶液，置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(注意孵育二抗及顯色過(guò)程需避光)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAdV-4 Fiber 1 基因的擴(kuò)增

收集接毒的LMH細(xì)胞，提取基因組，用設(shè)計(jì)的帶有同源臂的引物進(jìn)行Fiber 1基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增。如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在1 341 bp處有單一的擴(kuò)增條帶。帶有同源臂的PCR產(chǎn)物與XhoⅠ和HindⅢ雙酶切的pCold Ⅰ載體通過(guò)同源重組酶連接后，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌株送公司測(cè)序，通過(guò)Megalign軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果，確定pCold Ⅰ-Fiber 1重組載體構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Maker;1.Fiber 1基因;2.陰性對(duì)照

2.2 融合蛋白在Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

SDS-PAGE結(jié)果表明無(wú)論在16 ℃過(guò)夜還是37 ℃ 4 h誘導(dǎo)表達(dá)條件下，F(xiàn)iber 1融合蛋白均以包涵體的形式存在，分子質(zhì)量約53 kDa，與預(yù)期大小一致(圖2)。采用鎳柱純化重組蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化的蛋白條帶單一，純化效果良好(圖3)。各管測(cè)定蛋白濃度后，取高于0.5 mg/mL的蛋白進(jìn)行后續(xù)的乳化免疫程序。

M.蛋白Marker；1、7.pCold Ⅰ誘導(dǎo)前；2、8.pCold Ⅰ誘導(dǎo)后；3、9.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導(dǎo)前；4、10.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導(dǎo)后全菌；5、11.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導(dǎo)上清；6、12.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導(dǎo)沉淀

M.蛋白Marker；1～5.16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)后表達(dá)蛋白純化的洗脫液；6～10.37 ℃ 4 h誘導(dǎo)表達(dá)蛋白純化的洗脫液

2.3 ELISA檢測(cè)二免、三免后血清抗體水平

第2次免疫1周內(nèi)和第3次免疫1周內(nèi)，分別通過(guò)兔耳緣靜脈采血方法收集兔血4 mL并分離血清。ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)，如表1所示，二免后血清抗體效價(jià)達(dá)到104，故選擇繼續(xù)免疫1次，三免后測(cè)得抗體效價(jià)達(dá)到105以上，心臟采血收集陽(yáng)性血清。

表1 ELISA檢測(cè)二免、三免后血清抗體效價(jià)水平

2.4 Western blot驗(yàn)證多克隆抗體的反應(yīng)性

用FAdV-4感染LMH細(xì)胞，3 d后細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變時(shí)收樣，與誘導(dǎo)、未誘導(dǎo)的pCold Ⅰ空載以及重組蛋白pCold Ⅰ-Fiber 1全菌進(jìn)行Western blot，驗(yàn)證多克隆抗體的特異性。如圖4所示，在約53 kDa處Fiber 1多克隆抗體能夠與Fiber 1蛋白以及全病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生明顯的反應(yīng)，而相同位置的空載對(duì)照組無(wú)明顯條帶，說(shuō)明試驗(yàn)所得的Fiber 1多克隆抗體特異性良好。

M.蛋白Marker；1.pCold Ⅰ空載體對(duì)照；2.pCold Ⅰ-Fiber 1蛋白；3.未感染的LMH細(xì)胞；4.FAdV-4感染LMH細(xì)胞

2.5 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體

FAdV-4感染LMH細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞板，將Fiber 1多抗血清以及陰性血清按不同比例進(jìn)行稀釋?zhuān)?7 ℃ 孵育1.5 h后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶400倍)二抗37 ℃避光孵育45 min，而后在熒光顯微鏡下觀察。如圖5所示，陰性血清1∶200稀釋時(shí)無(wú)非特異性背景，陰性對(duì)照成立，F(xiàn)iber 1多抗陽(yáng)性血清稀釋至1∶3 000時(shí)仍可觀測(cè)到熒光，且特異性良好。

A.一抗1∶200；B.一抗1∶1 500；C.一抗1∶3 000；D.陰性對(duì)照1∶200

3 討論

FAdV-4自2015年在中國(guó)暴發(fā)以來(lái)，迅速擴(kuò)散至新疆、湖北、河南、山東、黑龍江、江蘇、陜西等各個(gè)地區(qū)[18]。在2015年至2016年在中國(guó)各地區(qū)顯示包涵體肝炎(IBH)和心包積液綜合征(HPS)家禽中分離到105株FAdV，F(xiàn)AdV-4感染率高達(dá)93%，其中64.8%為FAdV-4單獨(dú)感染，表明FAdV-4是中國(guó)目前造成不同品種雞高死亡率的優(yōu)勢(shì)血清型[19]。Pan等[20]通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)分離到的高致病性FAdV-4基因組區(qū)域與非致病性毒株相比，存在獨(dú)特的1 966 bp核苷酸缺失，并在Fiber 1、Fiber 2、Penton和Hexon上也發(fā)現(xiàn)多種不同的氨基酸取代。因此，對(duì)病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行深入研究，對(duì)了解FAdV-4的流行情況和致病機(jī)制具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)FAdV-4致病機(jī)制研究和病原檢測(cè)以及抗體的制備主要針對(duì)Hexon與Fiber 2蛋白。有文獻(xiàn)構(gòu)建和拯救一系列致病或非致病的FAdV-4的嵌合病毒，結(jié)果表明Fiber 2與Hexon蛋白可能與病毒毒力密切相關(guān)[21]。Steer等[22]通過(guò)檢測(cè)FAdV-Hexon基因P1和L1區(qū)域的差異，從而對(duì)不同種FAdV進(jìn)行檢測(cè)，可精確區(qū)分12種FAdV血清型。與此同時(shí)，F(xiàn)iber 2蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化，以重組蛋白為基礎(chǔ)的間接ELISA等檢測(cè)方法也成功建立[23]。但目前有關(guān)Fiber 1感染病毒的具體作用機(jī)制研究較少，相關(guān)的快速血清學(xué)診斷方法尚未開(kāi)發(fā)。

本研究通過(guò)同源重組方法成功構(gòu)建了pCold Ⅰ-Fiber 1原核表達(dá)載體，證實(shí)在37和16 ℃條件下Fiber1蛋白均可高效表達(dá)在包涵體中。免疫純化蛋白后的兔血清，ELISA效價(jià)達(dá)1∶100 000，Western blot檢驗(yàn)結(jié)果顯示該血清抗體既能夠識(shí)別重組載體pCold Ⅰ-Fiber 1中的Fiber 1 蛋白也可識(shí)別FAdV-4全病毒中的Fiber 1蛋白，但原核表達(dá)Fiber 1蛋白的大小比全病毒的略大，分析其原因是在Fiber 1的ATG起始密碼子前面第69位核苷酸處，pCold Ⅰ載體自身有蛋白表達(dá)的起始密碼子，所以與FAdV-4病毒中的Fiber 1大小略有不同。為進(jìn)一步驗(yàn)證Fiber 1多克隆抗體的可靠性，間接免疫熒光檢測(cè)了FAdV-4全病毒與Fiber 1多克隆抗體的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔多抗血清稀釋3 000倍后依然具有較高的活性，證明制備所得的多克隆抗體反應(yīng)性與特異性良好。本研究制備的Fiber 1多克隆抗體可為進(jìn)一步研究FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮的作用機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。