吳子辰，薛天涵，呂東海，成艷芬，朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學消化道微生物實驗室，江蘇 南京 210095)

近些年隨著社會逐漸穩(wěn)定，人們生活水平進一步提高，養(yǎng)殖業(yè)的重心從提高動物生長性能、生產(chǎn)效益逐漸轉為關注動物健康、飼料安全以及畜產(chǎn)品品質等方面。植物甾醇是一種新型功能性綠色飼料添加劑，屬于植物性甾體化合物，具有植物活性成分[1]。自然界中存在的植物甾醇分為游離型和酯化型，酯化型的植物甾醇更易溶于有機溶劑，其吸收利用率比游離型高約5倍，其功能作用也更加廣泛[2]。明珠等[3]報道在大鼠飲食中加入一定量的植物甾醇可以有效降低血液中膽固醇含量，預防心腦血管疾病，保護肝臟和血管。近年來，人們又發(fā)現(xiàn)植物甾醇具有抗炎、抗癌、抗氧化的作用，并且具有很高的安全性[4]。目前，植物甾醇已廣泛應用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)，并也應用于農(nóng)業(yè)上。植物甾醇在水產(chǎn)、禽類、單胃動物上的研究發(fā)現(xiàn)，適宜的添加量可以降低體內(nèi)膽固醇含量，改善動物體質，提高生產(chǎn)效率進而提高經(jīng)濟效益[5-6]。謝心美等[7]在奶牛中的研究也發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加200 mg/d植物甾醇可顯著提高奶牛的泌乳量，縮短首次參配時間和空懷時間，改善奶牛體質。

植物甾醇包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等，其組分不同，各甾醇含量和比例也不同。本研究旨在比較不同組分植物甾醇對瘤胃發(fā)酵的影響，為植物甾醇在反芻動物中的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗所用5個植物甾醇樣品由南京諾齊生物科技有限公司提供，植物甾醇含量均>90%，不同植物甾醇樣品植物甾醇組分含量不同(表1)，分別標記為甾醇A～E。

表1 不同組分植物甾醇產(chǎn)品成分表 %

每個甾醇樣品分3個梯度濃度進行瘤胃液體外發(fā)酵。3個濃度梯度分別為0.03、0.1、0.2 μg/mL，不添加植物甾醇作為試驗對照組。發(fā)酵底物為600 mg全混合日糧。

參照文獻[8]的方法配置人工瘤胃培養(yǎng)液，將4層紗布過濾后的瘤胃液與人工瘤胃營養(yǎng)液以1∶5體積比混合，總體積60 mL分裝于120 mL發(fā)酵瓶內(nèi)，39 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。分別于3、6、9、12、24 h測定產(chǎn)氣量。發(fā)酵結束時，立即測定發(fā)酵液pH值，取發(fā)酵液-20 ℃冷凍保存用于測定微生物蛋白、乳酸、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸含量。發(fā)酵底物65 ℃烘干，稱重用于計算底物干物質降解率。

1.2 指標測定

參照文獻[9]的方法測定產(chǎn)氣量，底物干物質降解率的測定參照文獻[10]的方法，將發(fā)酵瓶內(nèi)物質固液分離的同時洗滌發(fā)酵瓶中的殘渣并將其與對應樣品混合后在65 ℃烘干48 h，稱重并根據(jù)差量法計算樣品干物質降解率。體外發(fā)酵結束后培養(yǎng)液乳酸濃度的測定參照文獻[11]的方法，微生物蛋白濃度的測定參照文獻[12]的方法，氨態(tài)氮濃度的測定采用文獻[13]的苯酚-次氯酸鈉比色法，揮發(fā)性脂肪酸測定方法參考文獻[14]的方法，包括測定總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行雙因素方差分析和顯著性檢驗，多重比較采用Duncan法。試驗結果以“平均值±標準誤”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同組分植物甾醇對乳酸濃度的影響

通過對整體甾醇添加量分析(表2)，發(fā)酵結束時添加植物甾醇的試驗組乳酸濃度與對照組相比均有所降低，濃度為0.03 μg/mL的B甾醇組乳酸濃度最低(0.17 mmol/L)。

2.2 不同組分植物甾醇對發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

不同組分植物甾醇對瘤胃體外發(fā)酵各時間點產(chǎn)氣量的影響見圖1。隨著發(fā)酵持續(xù)進行，累積產(chǎn)氣量呈逐漸上升的趨勢。各時間點各組產(chǎn)氣量均高于對照組。24 h發(fā)酵終止時，濃度為0.03 μg/mL的B甾醇組累積產(chǎn)氣量最高(57.33 mL)，對照組最低(38.07 mL)。

圖1 不同組分植物甾醇對瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

2.3 不同組分植物甾醇對發(fā)酵液pH值、氨態(tài)氮、微生物蛋白以及干物質降解率的影響

表2顯示了添加植物甾醇對瘤胃體外發(fā)酵各項指標的影響。甾醇濃度對pH變化影響顯著(P<0.05)，試驗組發(fā)酵液pH均比對照組低，且各組的pH均保持在正常范圍內(nèi)。甾醇組分和濃度對發(fā)酵液pH沒有顯著交互作用(P>0.05)。甾醇濃度對產(chǎn)氣量的影響顯著(P<0.05)，其中添加濃度為0.03 μg/mL組平均總產(chǎn)氣量最高，0.2 μg/mL組最低，組分和濃度對體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量有顯著的交互作用(P<0.05)。甾醇濃度對乳酸濃度影響顯著(P<0.05)，甾醇組分和濃度對發(fā)酵液乳酸濃度交互作用不顯著(P>0.05)。甾醇種類對發(fā)酵液氨態(tài)氮濃度有顯著影響(P<0.05)，D組濃度最高，A組其次，B組最低且顯著低于D組和A組(P<0.05)。甾醇組分和濃度對發(fā)酵液氨氮濃度沒有顯著交互作用(P>0.05)。發(fā)酵24 h時，甾醇濃度對發(fā)酵液微生物蛋白濃度影響顯著(P<0.05)；C組添加植物甾醇為0.1和0.2 μg/mL時，微生物蛋白濃度顯著高于0.03 μg/mL(P<0.05)。甾醇組分和濃度對發(fā)酵液微生物蛋白濃度有顯著的交互作用(P<0.05)。通過對干物質降解率對比可以看出，甾醇組分對發(fā)酵液干物質降解率有顯著影響(P<0.05)，對A組影響最大，其次是B組。甾醇濃度對發(fā)酵液干物質降解率影響顯著(P<0.05)，其中0.03 μg/mL組平均干物質降解率最高。甾醇組分和濃度對發(fā)酵液干物質降解率有顯著的交互作用(P<0.05)。

表2 植物甾醇對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4 不同組分植物甾醇對微生物代謝產(chǎn)物的影響

不同組分植物甾醇對瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響見表3。甾醇濃度對總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸以及乙酸/丙酸影響顯著(P<0.05)，其中0.03 μg/mL組總揮發(fā)性脂肪酸、丙酸和丁酸顯著高于其他濃度以及對照組(P<0.05)，添加濃度為0.03 μg/mL的B甾醇組丙酸濃度最高，為20.05 mmol/L，乙酸/丙酸3個濃度梯度組均顯著高于對照組(P<0.05)。甾醇組分也可以顯著影響乙酸/丙酸(P<0.05)，乙酸/丙酸最高的是D組，顯著高于最低組B組(P<0.05)。甾醇組分和濃度只對乙酸/丙酸有顯著的交互作用(P<0.05)。

表3 植物甾醇對瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的影響

3 討論

反芻動物消化道功能結構與單胃動物有著很多的不同之處，適用于單胃動物的飼料添加劑種類與添加量并不一定同樣適用于反芻動物。植物甾醇本身吸收率比較低，一般以乳糜微粒的形式被畜體吸收。自然來源的植物甾醇都是混合的，其本身是疏水性的，并傾向于形成穩(wěn)定的晶體[15]。相比之下，純化后的利用率會提高一些。脂肪在瘤胃中消化很重要的一部就是加氫酯化，酯化的方式能夠提高植物甾醇生物利用率，大量的研究證據(jù)表明,容易被酯化的各種植物甾醇更容易被腸道吸收[16]。由此推測植物甾醇可能會對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生一些影響。由于植物甾醇在純化時不會溶解而且無生物活性，因此需要特別注意確保通過脂肪溶解或乳化使商業(yè)補充劑產(chǎn)品具有生物可利用性[17]。

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是判斷瘤胃發(fā)酵功能優(yōu)劣的重要指標之一，往往較高的產(chǎn)氣量意味著更徹底的消化[18]。本試驗多個試驗組的產(chǎn)氣量均顯著高于對照組，并且不同甾醇濃度產(chǎn)氣量也有變化，這與先前類似的試驗結果一致[19]。干物質降解率和產(chǎn)氣量相似，都可以反映體外瘤胃消化的程度，添加0.03 μg/mL植物甾醇會使干物質降解率有所提升，但添加植物甾醇的量有一定范圍，過多可能會產(chǎn)生負面影響，在干物質降解率上可能存在劑量抑制性。

瘤胃pH是評定瘤胃發(fā)酵功能的一項重要生理指標，在正常飼喂條件下，瘤胃內(nèi)的pH應保持在5.8～6.8，低于5.5時即可診斷為瘤胃酸中毒[20]。本試驗結果顯示，到24 h發(fā)酵結束時，試驗各組pH值均顯著低于對照組，但都控制在6.2以上，沒有超出正常范圍，并不會對瘤胃本身產(chǎn)生有害的影響。可能大部分微生物得到了充足的能量供應，使其生長速度大幅度提高，瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸的濃度升高，pH下降[21]。

揮發(fā)性脂肪酸是反芻動物瘤胃發(fā)酵的主要產(chǎn)物之一，可以將含氮化合物降解為氨，是反芻動物生產(chǎn)與維持最主要的能量組分，用于合成脂肪或者轉化成其他物質提供能量[22]。瘤胃動物正是以揮發(fā)性脂肪酸提供能量的方式充分利用人類不能利用的纖維類物質。本試驗結果顯示，甾醇處理組的總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸以及乙酸/丙酸與對照組相比均有所提升，而這也可能導致了pH值的下降。

氨態(tài)氮可以反映出飼料中蛋白質的降解效率，是微生物蛋白的合成必不可少的原料，其濃度必須保證在一個適宜的范圍內(nèi)，否則會影響微生物的生物活性。有研究表明其最適濃度應該保證在10～50 mg/dL[23]。本試驗氨態(tài)氮濃度始終保持在14 mg/dL左右，處于合適的濃度范圍，且上下浮動很小。在本試驗中氨態(tài)氮濃度只與甾醇種類有顯著相關性，其中B組甾醇最低。微生物蛋白是反芻動物最主要的氮源供應者，其濃度反映了瘤胃利用氨態(tài)氮的能力，可以滿足反芻動物蛋白質需要的40%～80%。添加0.1 μg/mL植物甾醇的組別氨態(tài)氮水平最低，0.03 μg/mL組最高，而微生物蛋白呈現(xiàn)的結果卻與之相反，可能氨態(tài)氮是作為菌體蛋白合成的氮源，經(jīng)瘤胃微生物轉化成微生物蛋白，并存在一定劑量范圍，在此范圍內(nèi)才能保證瘤胃微生物的正常生長，維持動態(tài)平衡。

乳酸是瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的中間產(chǎn)物，通常在瘤胃中的含量不高，其解離常數(shù)(3.9)遠小于揮發(fā)性脂肪酸的解離常數(shù)(4.8)，乳酸對瘤胃pH值的貢獻率為揮發(fā)性脂肪酸的近10倍[24]。人們通常認為揮發(fā)性脂肪酸含量越高，乳酸含量則越低，瘤胃乳酸在瘤胃中的累積導致瘤胃pH值急劇下降，引起機體代謝紊亂，多余的乳酸會隨血液擴散全身，危及動物健康。本研究中甾醇處理組乳酸含量均明顯下降，B組下降幅度最大，表示植物甾醇可能具有降低乳酸含量促進其轉化為揮發(fā)性脂肪酸的功效。

一些研究表明β-谷甾醇由于其C-24位基團的碳原子數(shù)目較多與菜油甾醇相比不易被動物吸收，其雙鍵飽和后形成的谷甾烷醇幾乎不被吸收，而豆甾醇在這3種甾醇主要成分中最難被吸收[25-26]。甾醇B在體外發(fā)酵試驗中效果較好可能是其β-谷甾醇含量最低，而β-谷甾醇在幾種甾醇中占比最高，接近一半，所以影響較大。

總之，添加植物甾醇可以提高微生物發(fā)酵的產(chǎn)氣量及揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，同時降低乳酸產(chǎn)量。植物甾醇的添加量比甾醇組分對瘤胃發(fā)酵影響更大。綜合多個瘤胃發(fā)酵指標考慮，添加甾醇B添加量為0.03 μg/mL對瘤胃發(fā)酵的促進作用最明顯。