杜海林，張文勇，楊紹兵，賈紹斌

血清同型半胱氨酸（Hcy）是人體經食物攝入的一種含硫氨基酸，異常升高的Hcy可通過多種不同機制誘導疾病的發(fā)生[1]。在Hcy誘導疾病發(fā)生的機制中，內質網應激（ERS）是近年來備受關注的研究熱點[2]。生理條件下，ERS相關蛋白胰腺內質網激酶（PERK）處于失活狀態(tài)。病理狀態(tài)下，PERK與未正確折疊的蛋白結合，觸發(fā)未折疊蛋白反應（UPR），從而發(fā)揮細胞保護作用[3]。如損傷因素誘發(fā)的ERS持續(xù)存在，PERK磷酸化為磷酸化PERK（p-PERK）,激活CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）以及其下游靶點內質網氧化還原酶α（ERO1α），而活化后的CHOP和ERO1α被認為是細胞凋亡的啟動因子[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，除動脈粥樣硬化導致缺血外，Hcy亦是導致慢性心力衰竭的又一獨立危險因素[6]。目前Hcy通過ERS導致動脈斑塊形成的研究較多，而Hcy對心肌直接影響尚鮮見報道。為研究Hcy是否直接介導了心肌損傷，本課題組設計了此項實驗，旨在探討血清Hcy對心肌的損傷作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗時間為2016年11月10日至2018年1月16日。實驗小鼠（SPF級）由北京大學實驗動物中心提供，并通過寧夏醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準；動物生長維持飼料及高蛋氨酸（HM）飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司；ERS阻斷劑4-苯基丁酸(4-PBA)，購自Sigma公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀；鼠抗β-actin單抗購自中杉金橋；ER-Stress抗體試劑盒購自CST公司；Hcy測定試劑盒購自山東博邁達生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒及BCA蛋白含量檢測試劑盒均購自凱基生物。

1.2 動物模型的建立

健康5周齡ApoE基因敲除實驗小鼠27只，均于實驗動物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，隨機分為對照組、HM組及4-PBA組，每組各9只。對照組給予小鼠生長維持飼料喂養(yǎng)，HM組及4-PBA組給予HM飼料喂養(yǎng)。Hcy是蛋氨酸代謝的中間產物，給予高蛋氨酸飲料喂養(yǎng)用于構建小鼠高Hcy血癥模型。所有實驗小鼠喂養(yǎng)16周后，4-PBA組給予腹腔內注射ERS阻斷劑4-PBA[7]，劑量為5 mg/kg,每周兩次，共12周，其余兩組小鼠均按原飼養(yǎng)方法繼續(xù)喂養(yǎng)12周。所有小鼠共完成28周干預后處死，快速眼球取血用于后續(xù)實驗，心臟經多聚甲醛灌注后剝離，留取標本分別固定及凍存，其中固定標本浸泡于4%多聚甲醛，凍存標本經液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.3 血清Hcy測定

所有小鼠全血經4 000 g離心10 min后取上層血清，使用Hcy測定試劑盒檢測血清Hcy濃度，首先用試劑盒內標準樣品制作標準曲線，曲線R2=0.997，再將每個樣本檢測三次，取三次結果的平均值作為該小鼠血清Hcy濃度，分組記錄。

1.4 電鏡觀察心肌細胞器

剝離小鼠心臟后采集心肌組織，在4℃環(huán)境下行前固定、后固定、脫水、分組包埋，分別取心肌細胞橫軸及縱軸切片，電鏡下3 000倍觀察細胞器。

1.5 心肌組織蘇木素-伊紅（HE）染色及免疫組化

所有固定心肌組織經脫水后行石蠟包埋及切片，常規(guī)脫蠟、脫水，HE染色觀察各組小鼠心肌大體結構及細胞結構。免疫組化切片繼續(xù)行高壓修復，山羊血清封閉，加ERO1α單克隆抗體于4℃冰箱過夜，次日按辣根過氧化物本酶（DAB）顯色試劑盒操作，并行HE染色，封片，正置顯微鏡下觀察染色效果，采集圖像。

1.6 心肌組織蛋白免疫印跡（Western blot）

稱取凍存心肌組織50 mg，使用全蛋白提取試劑盒，按試劑盒操作說明完成蛋白提取，BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測蛋白含量，取60 μg蛋白樣品，以10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫下脫脂牛奶封閉 90 min，加入一 抗PERK(兔 源1 :1 000)、CHOP(鼠源1 :1 000)、ERO1α(兔源1 :1 000)、β-actin(鼠源1 :2 000)于4℃孵育過夜，次日洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育 1 h，ClinxChemiScope6300自動曝光，并使用設備配套軟件分析條帶灰度值，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參。

1.7 統(tǒng)計學方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計包分析。連續(xù)變量采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組之間比較使用方差分析；所有統(tǒng)計均采用雙側檢驗，當P≤0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清Hcy測定評估模型建立

與對照組比較，HM組及4-PBA組血清Hcy水平增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與HM組比較，4-PBA組血清Hcy水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），如圖1所示。

圖1 三組小鼠血清Hcy水平比較(n=9)

2.2 心肌組織結構及細胞器的形態(tài)學觀察

通過光鏡觀察HE染色的心肌切片，分別在100倍及200倍鏡下觀察。三組心肌細胞HE染色良好，心壁無明顯增厚及變薄，心肌細胞形態(tài)正常，胞質均勻，無病理性核分裂相，光鏡下各組心肌組織未見明顯差異（圖2A）。電鏡下觀察所見，胞核細胞器形態(tài)正常，HM組內質網腫脹，結構紊亂，在多個切面可見內質網腔擴張，4-PBA組內質網腫脹及擴張明顯減輕，偶有視野可見上述改變（圖2B）。

2.3 ERO1α的免疫組化結果

光鏡下觀察免疫組化效果，由于ERO1α表達于胞漿，先于低倍鏡下觀察大體表達差異，再計數(shù)高倍鏡下每視野胞漿著色細胞與該視野細胞總數(shù)之比，作為ERO1α表達的定量指標。每組計數(shù)五個視野，分別計算每個視野陽性細胞百分數(shù)，將五個視野的平均百分數(shù)作統(tǒng)計學分析,如圖3所示，與對照組比較，HM組及4-PBA組胞漿中ERO1α表達增加,差異均有顯著性統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）；與HM組比較，4-PBA組胞漿ERO1α表達減少，差異有顯著性統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖2 蘇木素-伊紅染色光鏡觀察心肌組織結構及電鏡下觀察內質網結構

圖3 免疫組化法顯示ERO1α在不同組間表達

2.4 Western blot檢測PERK、CHOP、ERO1α在心肌組織中表達（圖4）

PERK、CHOP、ERO1α等內質網應激相關蛋白在對照組心肌細胞有少量表達，與對照組比較，HM組PERK、CHOP、ERO1α表達均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01)；與對照組比較，4-PBA組PERK、ERO1α表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01)，CHOP表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HM組比較，4-PBA組PERK、CHOP、ERO1α表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖4 蛋白免疫印跡法顯示PERK、CHOP、ERO1α在各組中表達

3 討論

人體經食物攝入的蛋氨酸經過代謝產生具有毒性作用的中間產物--Hcy，目前各領域相關研究證實其毒性作用表現(xiàn)為致全身多系統(tǒng)疾病，包括2型糖尿病、惡性腫瘤、腎臟疾病及動脈粥樣硬化等[8-9]，本課題組研究第一次從病理角度觀察到Hcy對心肌的直接損傷，在心肌大體組織結構并無明顯改變時，Hcy已通過超微結構變化，影響心肌細胞功能。

心血管疾病與腫瘤是近年WHO公布的主要疾病譜，心血管疾病危險因素包括吸煙、高血壓、高脂血癥、糖尿病等，近年將缺乏運動及血清高Hcy（≥10 μml/L）列為心血管疾病的危險因素[10]。關于Hcy與心血管疾病相關性，目前較為明確的有：（1）Hcy通過影響烷類物質及嘌呤的代謝，導致超氧化陰粒子堆積，誘發(fā)氧化應激[11]；（2）高血清Hcy導致氧化低密度脂蛋（ox-LDL）異常表達[12]，誘導血管中層平滑肌細胞增殖加速動脈粥樣硬化（AS）[13]；（3）誘導生長抑制因子和DNA損傷誘導因子（GADD34）以及T細胞死亡基因51（TDAG51）表達，誘發(fā)ERS[14]。本課題組實驗結果顯示，給予小鼠28周高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)，血清Hcy水平增高，由于4-PBA作用于Hcy所致ERS的下游[15]，并未導致HM組與PBA組小鼠Hcy水平的差異，成功構建高Hcy模型。與對照組比較，HM組心肌細胞ERS相關因子PERK、CHOP、ERO1α表達均有增高，盡管光鏡下組織大體形態(tài)結構沒有明顯變化，但細胞超微結構已存在改變，給予4-PBA阻斷ERS后以上因子表達下降、內質網腫脹亦有所改善,提示血清Hcy水平增高觸發(fā)ERS，而阻斷ERS通路后，CHOP、ERO1α等因子表達下降，細胞超微結構的變化亦有所改善。細胞中表達增高的CHOP及ERO1α的被認為是病理性ERS的觸發(fā)因子[14]，由此證實長時間血清高Hcy水平損傷心肌細胞，其機制可能為高Hcy激活ERS所致，當過度的損傷超過了UPR的代償能力，細胞內環(huán)境的穩(wěn)定將無法維持，此時ERS會激活線粒體凋亡通路，誘導損傷細胞凋亡[16]，心肌細胞凋亡后會繼續(xù)發(fā)生心肌重構，最終導致慢性心力衰竭的發(fā)生[5]。

目前對高Hcy的防治主要策略是在食物或藥物中加用葉酸及維生素B12加速其代謝[17]，這類治療策略的顯著特點是以降低血清Hcy水平為目的。近來一些臨床相關的Meta分析顯示，補充葉酸治療可以降低腦血管事件，但并不能降低心血管事件的風險[18]。因此需要探索新的手段對臨床高Hcy進行干預。4-PBA作為一種小分子脂肪酸，起初應用于鐮狀細胞貧血和地中海貧血的臨床治療，近年研究證實其為一種分子伴侶，可逆轉未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白而減輕ERS，在本實驗中，我們對同樣為血清高濃度Hcy的4-PBA組小鼠給予4-PBA干預，目的是通過阻斷ERS通路后，檢測ERS相關因子的表達，結果顯示其ERS相關因子CHOP、ERO1α表達確有下降，電鏡下內質網結構也確有改善，再次證實高Hcy血癥觸發(fā)了ERS而介導的心肌損傷。其機制可能是4-PBA作為分子伴侶，協(xié)助信號分子指導蛋白折疊，減輕ERS負擔，從而抑制 CHOP以及其下激分子ERO1-α轉錄和翻譯，減輕心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用[19]。4-PBA干預后出現(xiàn)細胞超微結構及分子水平的改變進一步佐證Hcy通過ERS介導心肌損傷，并提示阻斷ERS可能為干預Hcy所致心臟病的一個新靶點[20]。

此外我們的研究仍然存在不足之處，如未設計正常飼料喂養(yǎng)組并經4-PBA組，無法說明4-PBA對心肌單獨效應；未進一步探討CHOP及ERO1α經過何種改變導致表達增加，如是否和基因的乙酰化和甲基化過程相關等，以上不足。我們將會在后續(xù)的細胞實驗中加以完善。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突