郭海燕，張耀光

(1.西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶市水產科學重點實驗室，重慶 400715；2.重慶市水產科學研究所，重慶 400020)

沒食子酸(gallic acid，GA)，又名五倍子酸、棓酸，化學名稱為3，4，5-三羥基苯甲酸(3,4,5-Trihydroxybenzoic acid)，是自然界存在的一種多酚類化合物，廣泛存在于五倍子、烏桕、訶子、葡萄、茶葉等多種天然植物中[1,2]。它因其結構本身含有三個羥基而具有較強的抗氧化性[3,4]，另外許多植物多酚類物質也被證實對多種病原菌和真菌具有抑制和殺滅作用[3-7]。在我國水產養(yǎng)殖上常將沒食子酸或以沒食子酸為有效成分的中草藥用作抗菌劑防治水產動物疾病和添加到食物、飼料中阻止因脂類氧化等原因導致的腐敗[8-13]。

藥物和化學物質經皮膚、腸和鰓通過血液循環(huán)被輸送到魚體的其它組織，而紅細胞是它們最先直接接觸并受影響的細胞之一[14]。由于紅細胞容易得到、易于制備、富有不飽和脂肪酸和蛋白質并且攜帶豐富信息，因此經常被用于進行氧化損傷的研究[15，16]。南方鲇(Silurusmeridionalis)隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridae)鲇屬(Silurus)，是我國長江流域特有的經濟魚類。作為水產動物常用的藥物，沒食子酸常被作為中草藥的有效成分對水產動物進行藥代動力學[11，17-19]和藥效學[7，12，13，20]方面的研究，抗氧化方面的內容也有所涉及，如沒食子酸在淡水鮐貝[21-23]、斑馬魚[24，25]和南方鲇[26]等方面的研究。本實驗以南方鲇紅細胞為實驗對象研究沒食子酸對紅細胞抗氧化系統(tǒng)和表面形貌的影響作用，檢測相關氧化指標超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和脂類氧化(LPO)且觀察紅細胞相應的溶血和表面形貌的變化，以期對沒食子酸對魚類的抗氧化作用做進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源和馴養(yǎng)

實驗用魚為本實驗室自養(yǎng)健康二齡南方鲇，體重(1 492.90±84.8)g，全長(55.94±0.84)cm。養(yǎng)殖在實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內，養(yǎng)殖缸規(guī)格(80 cm×45 cm×50 cm)，每組系統(tǒng)上下各8個魚缸，每缸1尾魚，水流入速度25 mL/s，養(yǎng)殖用水是經脫氯、曝氣、充氧的24 h循環(huán)自來水，水溫控制在(26±2)℃，pH=(6.5±0.2)，溶氧大于6 mg/L，光周期設定為12 L ∶12 D。實驗期間每天投喂泥鰍，投喂后及時撈走養(yǎng)殖系統(tǒng)內的糞便和殘餌，日換水量約為馴化水體的10%。

1.2 紅細胞懸液的制備

實驗用紅細胞取自本實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)自養(yǎng)健康南方鲇。每次正式實驗前取新鮮血液，用一次性注射器尾靜脈抽血至預先經肝素鈉抗凝的EP管中。血液靜置片刻后于4 ℃，2 500 r/min離心10 min，棄上清液。繼續(xù)用0.65%滅菌生理鹽水清洗2～3次至上清液呈無色透明。使用時用生理鹽水制成1%的紅細胞懸液，即配即用。

1.3 化學試劑和儀器

沒食子酸對照品(GA，純度為90.1%)。肝素鈉購自西南大學附屬醫(yī)院?？偟鞍?、SOD、CAT、GPx和丙二醛(MDA)等試劑盒購自南京建成生物研究所。氯化鈉、戊二醛、乙醇、叔丁醇、乙酸乙酯、冰醋酸等試劑均為分析純。實驗用水均為超純水。儀器包括多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific Inc，Thermo)、紫外分光光度計(UV-2450，SHIMADZU)、掃描電鏡(JSM-6510LV，SHIMADZU)、離子濺射裝置(INCA X-Max 250)等。

1.4 實驗方法

實驗方法和濃度設定參考文獻[22，27]，且在其基礎上有所修改。

1.4.1 沒食子酸對健康南方鲇紅細胞溶血的測定

制備1%紅細胞懸液，加藥組各管加入不同濃度沒食子酸溶液，終濃度分別為5、10、20、40和80 mg/L，以不加藥物加入等量的生理鹽水為對照管，(27±0.5)℃分別孵育4 h和24 h，每個濃度重復三次。實驗過程中，避免外力促進紅細胞溶血。到達預定時間后，以1 000 r/min轉速離心5 min，取上清液于540 nm處測吸光度。

1.4.2 沒食子酸對健康南方鲇抗氧化酶和脂類氧化損傷的測定

制備1%紅細胞懸液，加藥組各管加入不同濃度沒食子酸溶液，終濃度分別為5、10、20、40和80 mg/L，以不加藥物加入等量的生理鹽水為對照管，(27±0.5)℃分別孵育4 h和24 h，每個濃度重復三次。實驗過程中，不要用力搖動EP管，避免外力促進紅細胞的溶血。到達預定時間時，以1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清留紅細胞沉淀，按照總蛋白、SOD、CAT和GPx及MDA試劑盒說明進行樣本前處理及測定操作?？偟鞍子肂CA法，脂類氧化損傷用硫代巴比妥酸反應法。

1.4.3 沒食子酸對健康南方鲇紅細胞表面形貌的影響

取上述紅細胞樣品1 000 r/min，離心10 min，用生理鹽水洗滌2～3次；2.5%戊二醛固定過夜，開始固定時應輕輕攪動，使樣品均勻分布在固定液中，固定結束，離心后棄上清，用生理鹽水清洗2～3次；30%、50%、70%、85%和95%濃度乙醇梯度脫水，逐級脫水各1次，每次浸泡10 mim，離心5 min，再用100%乙醇脫水兩次；用叔丁醇轉換2次，每次30 min，-20 ℃冰箱保存；-80 ℃冷凍干燥；將干燥完的樣品放入離子濺射裝置噴金150 s，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)按試劑盒說明書給定的公式進行計算，常規(guī)計算用EXCEL，后用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。全文數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(mean±SE)表示，統(tǒng)計上顯著性水平為P<0.05。

2 結果

2.1 沒食子酸對南方鲇紅細胞溶血的影響

(27±0.5)℃時健康南方鲇正常紅細胞分別在0、5、10、20、40和80 mg/L沒食子酸溶液中孵育4 h和24 h溶血情況如圖1。4 h組各濃度之間紅細胞溶血均不具有統(tǒng)計學意義差異，24 h組隨著沒食子酸濃度增大紅細胞溶血OD先降低后升高，與對照組相比，5 和10 mg/L濃度組溶血顯著降低，40 和80 mg/L 濃度組溶血顯著升高。

圖1 沒食子酸對南方鲇紅細胞溶血情況的影響

2.2 沒食子酸對南方鲇紅細胞抗氧化酶的影響

(27±0.5)℃時健康南方鲇正常紅細胞分別在0、5、10、20、40和80 mg/L沒食子酸溶液中孵育 4 h和24 h抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)的變化趨勢如圖2所示。SOD活力在4 h先升高再降低的趨勢，24 h時5 mg/L濃度組比對照組略有下降，接著上升然后再下降，兩組均在20 mg/L時達到最大值。CAT 活力在4 h時5、10 和20 mg/L濃度組與對照組差異不顯著，40與80 mg/L比20 mg/L顯著下降，但與對照組差異不顯著；24 h時隨著沒食子酸濃度的增大，CAT活力呈先升高再降低的趨勢變得比較明顯，最大值在20 mg/L時出現(xiàn)。GPx活力在4 h時5、10和20 mg/L濃度組比對照組有所增大，但是各濃度組之間差異不顯著，40和80 mg/L比對照組顯著降低；24 h時5、10和20 mg/L濃度組比對照組顯著升高，且10和20 mg/L之間差異不顯著，接著活力下降。并且三種酶同一濃度的酶活性24 h時比4 h時均有不同程度地降低。

圖2 沒食子酸對南方鲇紅細胞SOD、CAT及GPx活性的影響

2.3 沒食子酸對南方鲇紅細胞脂類過氧化的影響

MDA是硫代巴比妥酸反應的產物，它的含量可以反映機體脂類氧化的程度。經測定，(27±0.5)℃時健康南方鲇正常紅細胞分別在0、5、10、20、40和80 mg/L GA溶液中孵育 4 h和24 h MDA的水平隨著沒食子酸濃度的增大先降低后增大，4 h時20 mg/L MDA含量為最小，24 h時20 mg/L MDA含量達到最小，40和80 mg/L顯著高于對照組，而且同一濃度24 h的MDA含量遠遠大于4 h時的含量(圖3)。

圖3 沒食子酸對南方鲇紅細胞MDA含量的影響

2.4 沒食子酸對南方鲇紅細胞表面形貌的影響

分別在0、5、10、20、40和80 mg/L GA溶液中孵育 4 h和24 h，掃描電鏡下正常紅細胞呈卵圓形或橢圓形，表面光滑，均勻飽滿無可見的表面損傷。4 h除80 mg/L濃度組可以看到少數(shù)紅細胞表面略有皺縮變形，其它組與對照組無差異。24 h時 5、10、20 mg/L濃度組與對照組相比紅細胞均無變化，40和80 mg/L濃度組紅細胞表面損傷逐漸明顯，尤其是80 mg/L濃度組視野范圍內的紅細胞顯著減少，(27±0.5)℃時健康南方鲇正常紅細胞40和80 mg/L濃度組紅細胞的SEM表面形貌如圖4。

圖4 沒食子酸對南方鲇紅細胞表面形貌的影響

3 討論

紅細胞是機體血液循環(huán)系統(tǒng)維持內環(huán)境穩(wěn)定、運輸、調節(jié)、防御等功能的重要體現(xiàn)者，且紅細胞對氧化損傷作用極為敏感[28]。過氧化損傷的產生主要是由于內源性或外源性的某些物質，在一定條件下產生一系列過氧化反應生成自由基產物，如活性氧等，引起紅細胞膜磷脂不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，使膜磷脂組成發(fā)生改變，即不飽和脂肪酸比例降低，飽和脂肪酸比例增加，脂質過氧化還可以引起膜硬度的增加，從而導致紅細胞膜流動性降低，最終導致溶血[28]。為了對抗這些活性氧，機體為紅細胞配備了有效的酶和非酶抗氧化劑。SOD、CAT和GPx就是其中三種重要的抗氧化酶[29]。MDA的測定通常與抗氧化酶的測定相互配合來詮釋機體或細胞氧化水平。紅細胞表面形貌的變化通常在醫(yī)學、化學和新材料學上應用較多[28]，水產上較少應用。

3.1 沒食子酸對南方鲇紅細胞溶血和細胞存活率的影響

紅細胞溶血常用來計算紅細胞的存活率。4 h各濃度組紅細胞的溶血與對照組比較均沒有顯著差異，這說明各濃度組之間紅細胞的存活率是一致的，沒食子酸對紅細胞沒有明顯的細胞毒性，但此時抗氧化酶和脂類氧化的指標已經有一定的變化。24 h隨著濃度增大紅細胞的存活率先升高后降低。從紅細胞溶血的角度觀察，在較低濃度時(5和10 mg/L)時沒食子酸對南方鲇紅細胞有抗氧化作用而顯示出一定的保護作用，而在較高濃度時(40和80 mg/L)顯示出明顯的細胞毒性而導致紅細胞大量溶血。從圖1中看到，同一濃度的吸光度無論是未給藥組還是給藥組，24 h組均相應地大于4 h組，說明時間是紅細胞溶血和細胞存活率的重要因素。Yen等[30]研究發(fā)現(xiàn)37 ℃時人類正常淋巴細胞在0～0.24 mmol/L GA溶液中孵育30 min時未發(fā)現(xiàn)沒食子酸對其有明顯的細胞毒作用。Labieniec等[21]提出當?shù)愵愊偌毎诙喾宇愇镔|中孵育呈現(xiàn)出時間和濃度依賴性地減少，表現(xiàn)出一定的細胞毒性的特征但并未顯示出明顯的細胞毒性。這些研究都說明沒食子酸對細胞的存活率的影響與濃度、時間有一定關系。

3.2 沒食子酸對南方鲇紅細胞抗氧化酶的影響

Gil-Longo等[27]報道沒食子酸自氧化過程中會產生超氧負離子、過氧化氫和奎寧等活性氧，本實驗的結果說明了抗氧化酶的活性與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成過程與沒食子酸的濃度相關的。實驗數(shù)據(jù)顯示沒食子酸對南方鲇紅細胞的SOD、CAT和GPx活性有時間和濃度依賴性的影響。這與Techer等[24]研究GA對斑馬魚(組織勻漿物)的抗氧化酶活性的影響是非常一致的，均以20 mg/L或40 mg/L濃度時酶活性達到最大值，隨后降低，酶活性顯著被抑制的最低濃度是45 mg/L。本研究中三種酶在20 mg/L或以下的濃度時酶活性與對照組相比均有不同程度地顯著升高，而在20 mg/L濃度或以上的濃度時酶活性有所降低，這說明GA對南方鲇紅細胞的氧化作用有兩面性，結果顯示20 mg/L以下有抗氧化作用，而20 mg/L以上有促氧化作用。

3.3 沒食子酸對南方鲇紅細胞脂類過氧化的影響

Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸喂飼雄性快速老化小鼠30 d時，腦和肝里MDA水平比正常鼠有所降低。Yen等[30]研究Fe3+-H2O2介導的人淋巴細胞的氧化損傷時發(fā)現(xiàn)隨著沒食子酸濃度的增大(0.004～0.82 mmol/L)硫代巴比妥酸的生成增大，并且最大值的出現(xiàn)大于1.65 mmol/L，隨后TBARS的生成開始變小，說明沒食子酸對氧化損傷的保護作用有一定的濃度依賴。Gupta等[31]指出高濃度的多酚類物質自身能產生一定的毒性。本實驗的結果與這些理論吻合，較低濃度時(20 mg/L及以下濃度)沒食子酸可以降低南方鲇紅細胞脂類的氧化，而40 mg/L及以上濃度能促使脂類的進一步氧化。因此說較低濃度時沒食子酸對南方鲇的紅細胞有一定的保護作用。

3.4 沒食子酸對南方鲇紅細胞表面形貌的影響

紅細胞膜由整齊有序的磷脂雙分子層骨架和膜表面附著的外周蛋白共同組成，外界因素影響使其整齊有序性受到破壞，從而影響其正常功能[28,32]，進一步會導致表面形貌的變化。紅細胞在氧化過程中產生過多的活性氧對其脂質和蛋白質造成了損傷，Labieniec等[22]就多酚類物質對淡水鮐貝消化腺細胞膜脂質的流動性的研究中建議此類物質的膜脂質的流動性依賴于它們的化學結構(多羥基的數(shù)量和極性)，推測它們結合蛋白質的能力是導致膜質流動性和表面形貌變化的主要原因，但是質膜的水合部分流動性的原理還有待進一步研究。本研究結果顯示，低濃度時沒食子酸會對紅細胞的氧化有一定的保護作用，它們可以修飾某些蛋白，使它們結構松散，而高濃度時它們大部分覆蓋在蛋白表面，使它們的結構變得不穩(wěn)定而導致膜質流動[33]，達到一定濃度時即體現(xiàn)在紅細胞的表面形貌上。另據(jù)報道多酚類物質能與多種金屬螯合[15]，如Fe3+、Cu2+和Ca2+等，而Ca2+在細胞膜的穩(wěn)定方面起重要作用，這可能也是沒食子酸影響紅細胞表面形貌變化的原因之一。而紅細胞表面形貌的變化也正說明了細胞結構和功能的一致性。