李晶晶 王思蘆 李金娉 劉凱 肖文淵

摘要：為探究小柴胡湯及其拆方對肝細胞損傷的影響，建立四氯化碳（CCl4）致急性肝細胞損傷體外模型;給藥后用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)基中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）的含量和MTT法檢測細胞活率。結(jié)果表明，小柴胡湯及其組成成分中黃芩對CCl4損傷的肝細胞保護效果最好，其次是柴胡、黨參;小柴胡湯優(yōu)化試驗結(jié)果表明，保肝效果2號方劑高濃度組最好。對小柴胡湯及其拆方的抗肝細胞損傷效果進行探討分析，研究結(jié)果表明，2號方劑高濃度組可減緩CCl4致肝細胞損傷，培養(yǎng)基中ALT、AST、MDA水平顯著降低，有效減輕了CCl4所致的肝細胞病理損傷，對抗化學(xué)性肝細胞損傷具有輔助保護功能。

關(guān)鍵詞：中藥;四氯化碳（CCl4）;肝損傷;小鼠肝細胞;小柴胡湯

中圖分類號：S853.74

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0217-05

小柴胡湯出自張仲景《傷寒論》，由柴胡45 g、黃芩45 g、黨參45 g、半夏30 g、炙甘草15 g、生姜 20 g、大棗60 g組成[1]，是人醫(yī)臨床上用于治療肝硬化、肝纖維化、肝癌等肝病的經(jīng)典名方?，F(xiàn)代研究表明，小柴胡湯通過抵御肝功能減弱和四氯化碳（CCl4）、乙醇誘導(dǎo)的腸-肝-腦損傷和炎癥，降低了四氯化碳、乙醇誘發(fā)小鼠肝癌時的死亡率和肝癌發(fā)生率[2]。孫蘭等研究表明，中藥小柴胡湯對小鼠硫代乙酰胺、醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加均有一定的抑制作用[3];加味小柴胡湯對小鼠肝損傷有明顯的保護作用，是通過顯著地降酶、抗氧化、抑制脂質(zhì)過氧化及調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能發(fā)揮其抗肝損傷作用[4]。在獸醫(yī)臨床上多種致病因子容易引起肝細胞損傷，如肝炎病毒、細菌、寄生蟲和工業(yè)污染中的CCl4等都可直接或間接造成肝小葉壞死，嚴重的可引起肝功能衰竭、營養(yǎng)失衡等。肝損傷直接影響動物的消化功能，可導(dǎo)致動物消化不良、食欲減退、脂類代謝障礙等，更容易繼發(fā)其他疾病，如脂肪肝、感染性疾病、肝硬化、肝壞死、肝癌等，直接造成畜禽養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失[5]。小柴胡湯是人醫(yī)臨床治療多種肝臟疾病的經(jīng)典名方，現(xiàn)為將其開發(fā)成獸醫(yī)臨床上抗肝損傷有效、低成本的中獸藥，對其進行拆方。首先在7味中藥中找到保肝藥效較好的幾味藥材，再重新組合，并對其抗急性體外肝細胞損傷效果進行分析探討，旨在為該方劑在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

柴胡（CH）、黃芩（HQ）、黨參（DS）、半夏（BX）、甘草（GC）、生姜（SJ）、大棗（DZ）（購自西昌市長安大藥房）;小鼠肝細胞（NCTC 1469）、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、PBS、胎牛血清、青鏈霉素混合液（購自武漢普諾賽生命科技有限公司）;四甲基噻唑藍（MTT）（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;二甲基亞砜（DMSO）、四氯化碳、生理鹽水（購自成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠肝細胞株（NCTC 1469）的培養(yǎng) 將冷凍保存的NCTC 1469復(fù)蘇后，以1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液）培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細胞長至單層，以PBS洗3遍，再用1 mL 0.25%胰酶消化1.5 min，吹打成單個細胞懸液后計數(shù)并調(diào)節(jié)數(shù)量為1.5×105個/mL。在96孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加細胞懸液100 μL，48孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加細胞懸液500 μL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用于以下試驗。

1.2.2 CCl4致肝細胞損傷體外模型的建立

1.2.2.1 CCl4誘導(dǎo)肝細胞損傷單因素試驗 CCl4和DMSO用0.45 μm針式過濾器過濾后等比例混合，取混合物以培養(yǎng)基10倍稀釋至第3管，從第4管以2倍稀釋至第6管，得到6個不同CCl4終濃度，分別為160.0、16.0、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL，按“1.2.1”節(jié)方法進行細胞培養(yǎng)，經(jīng)48 h長至85% 96孔細胞培養(yǎng)板舊培養(yǎng)基棄去，將含以上6個不同濃度的含CCl4培養(yǎng)基每孔100 μL加入培養(yǎng)板，每個濃度6個重復(fù)，另設(shè)6個孔只加完全培養(yǎng)基作空白組，培養(yǎng)24 h后，檢測細胞活率，即每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT PBS溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加200 μL DMSO在微量振蕩器上振蕩 15 min，用酶標(biāo)儀測490 nm處的吸光度代表細胞活率，D490 nm值越大，細胞活率越高。

1.2.2.2 DMSO對肝細胞使用劑量的安全檢測 DMSO采用0.45 μm針式過濾器過濾，用培養(yǎng)基將DMSO配成0.10%、0.08%、0.06%、0.04%共4個濃度。將培養(yǎng)48 h長至85% 96孔細胞培養(yǎng)板舊培養(yǎng)基棄去，混勻含DMSO的培養(yǎng)基并迅速加液，每孔100 μL，每個濃度6個重復(fù)，另設(shè)6個孔加完全培養(yǎng)基作空白組，培養(yǎng)24 h后檢測細胞活率。

1.2.2.3 CCl4引起肝細胞損傷的2因子4水平正交試驗 該試驗是為了篩選出CCl4誘導(dǎo)肝細胞損傷的最佳作用濃度和作用時間組合。CCl4和DMSO等體積混合后用0.45 μm針式過濾器過濾，用培養(yǎng)基將CCl4配成1.6 mg/mL（0.10%）、1.3 mg/mL（0.08%）、0.9 mg/mL（0.06%）、0.6 mg/mL（0.04%）共4個濃度。將培養(yǎng)48 h長至85%的96孔細胞培養(yǎng)板舊培養(yǎng)基棄去，用混勻含CCl4的培養(yǎng)基迅速加液，每孔100 μL，每個濃度6個重復(fù)，6個孔加完全培養(yǎng)基作空白組，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)6組為建模成功，且可減少CCl4的用量以及培養(yǎng)時間。培養(yǎng)6、12、18、24 h后檢測細胞活率。

并用SPSS 21.0軟件進行分析得出CCl4濃度與作用時間的最佳組合，以該組合制備細胞模型的細胞活率顯著低于空白對照。

1.2.3 小柴胡湯及其拆方對體外CCl4致肝細胞損傷的影響

1.2.3.1 8種水煎劑的制備 采用常規(guī)煎煮法[2]分別制備小柴胡湯全方及其各味藥材的共8種水煎劑，以g（生藥質(zhì)量）/mL表示各水煎劑母液的濃度。

1.2.3.2 8種水煎劑對肝細胞最大安全濃度測定 將8種水煎劑以0.45 μm濾膜過濾后，采用細胞培養(yǎng)液將各中藥的水煎液通過2倍稀釋成6個不同濃度。取8個96孔板，分別用于檢測8種水煎劑的以上濃度對肝細胞活率的影響。各培養(yǎng)板按“1.3.1”節(jié)的方法分別接種等量細胞，培養(yǎng)48 h后，棄去舊培養(yǎng)基，每個板加入一種水煎劑，每個濃度6次重復(fù)，每個孔加100 μL含藥培養(yǎng)基;每個細胞培養(yǎng)板設(shè)6個孔加100 μL純培養(yǎng)基為空白組。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“1.2.2.1”節(jié)檢測細胞活率。

1.2.3.3 8種水煎劑對體外CCl4致肝細胞損傷的影響 以正交試驗篩選出的CCl4濃度及作用時間制備出體外肝細胞損傷模型，將“1.2.3.2”節(jié)篩出的各最大安全濃度的水煎劑以含CCl4的培養(yǎng)基2倍稀釋至第7管，得到7個供試濃度。取8個培養(yǎng)板，分別檢測8個水煎劑的不同濃度對體外CCl4致肝損傷的影響，每個濃度設(shè)6個重復(fù)，同時設(shè)有空白組和模型組。按“1.2.2.1”節(jié)檢測細胞活率。

1.2.4 優(yōu)化小柴胡湯對體外CCl4致肝細胞損傷的保護作用 將“1.2.3.3”節(jié)篩選出的最佳有效濃度的小柴胡湯水煎劑設(shè)為1號供試液;將“1.2.3.3”節(jié)篩選出與模型組比有顯著差異的單味中藥按原方比例混合藥材后，按“1.2.3.1”節(jié)制備水煎劑設(shè)為2號供試液;將“1.2.3.3”節(jié)中各單味藥的最佳有效濃度等比例混合后設(shè)為3號供試液。各供試液用含與“1.2.3.3”節(jié)相同濃度的含CCl4培養(yǎng)基2倍稀釋成高中低3個濃度。取1個48孔細胞培養(yǎng)板，接種細胞培養(yǎng)48 h后，棄去原培養(yǎng)基，設(shè)空白組、模型組、3個供試液不同濃度共11個組，每個組4個重復(fù)，其中空白組加500 μL培養(yǎng)基，模型組加 500 μL 含CCl4的培養(yǎng)基，其余各組分別加入不同濃度供試液的含CCl4培養(yǎng)基。按“1.2.2.1”節(jié)方法檢測細胞活率，并收集培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙二醛（MDA）含量的變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 21.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組數(shù)據(jù)間進行方差多重比較，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCl4誘導(dǎo)肝細胞損傷單因素試驗

由表1可知，160.0 mg/mL CCl4組、16.0 mg/L CCl4組的細胞活率顯著低于空白組（P<0.05），表明160.0～16.0 mg/mL CCl4會對肝細胞造成明顯的損傷;1.6 mg/mL CCl4組細胞活率與空白組和 16.0 mg/mL CCl4組細胞活率均無顯著性差異，為“1.2.2.3”節(jié)試驗使用的CCl4濃度提供參考。

2.2 DMSO對肝細胞使用劑量的安全檢測

由表2可知，與空白組相比，各試驗組不同濃度的DMSO對肝細胞活率的影響均無顯著性差異，表明DMSO的使用濃度對肝細胞無損傷作用，只有助溶效果，為試驗“1.2.2.3”節(jié)提供參考。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表3至表5可知，由Ⅲ型平方和比較可知，影響因素中CCl4濃度和培養(yǎng)時間對體外CCl4致肝細胞損傷模型都具有顯著性影響，2個因素的主次關(guān)系是CCl4濃度>培養(yǎng)時間，最佳組合應(yīng)為A2B4。試驗組D490 nm顯著低于空白組，表明肝細胞體外損傷模型建模成功。經(jīng)過正交試驗優(yōu)化的肝細胞損傷模型中CCl4濃度為1.3 mg/mL，培養(yǎng)時間為24 h。

2.4 小柴胡湯及其拆方后8種水煎劑對肝細胞的最大安全濃度

由表6可知，組成小柴胡湯的7味藥材中，安全濃度最大的是半夏（BX），安全濃度最小的是黃芩（HQ）。

2.5 8種水煎劑對CCl4致肝細胞損傷的影響

由表7可知，空白組細胞活性顯著高于模型組細胞活性，表明體外肝細胞損傷模型建立成功。CH組、HQ組的細胞活性顯著高于模型組細胞活性;XCHT組、DS組、GC組、BX組的細胞活性極顯著高于模型組，結(jié)果表明黃芩保肝效果最好，與模型組相比較細胞活率提高54.5%，其次是柴胡、黨參;除了生姜和黨參，其余各水煎劑對損傷的肝細胞有保護作用。

2.6 優(yōu)化小柴胡湯對體外CCl4誘導(dǎo)肝細胞損傷的保護作用

由表8可知，空白組細胞活性與模型組差異顯著，表明體外肝損傷模型建立成功。模型組肝細胞活性顯著低于1號方劑高濃度組、2號方劑高濃度組、3號方劑高、中濃度組，表明以上4組供試藥物及濃度對CCl4引起肝細胞損傷有顯著的抑制作用，且2號方劑高濃度組對肝細胞保護效果最好。

由表9可知，模型組比空白組MDA含量升高303.6%（P<0.01），AST含量升高68.9%（P<0.01），ALT含量升高57.3%（P<0.05）;1號方劑高濃度組與模型組比MDA含量降低70.4%（P<0.01）、AST含量降低38.3%（P<0.01）、ALT含量降低33.6%（P<0.05）;2號方劑高濃度組與模型組相比MDA含量降低73.0%（P<0.01）、AST含量降低39.4%（P<0.01）、ALT含量降低55.7%（P<0.05），說明2號方劑在該濃度時也有效抑制了CCl4對肝細胞的損傷;3號方劑高濃度組與模型組相比MDA含量降低71.3%（P<0.01）、AST含量降低37.1%（P<0.01）、ALT含量降低39.3%（P<0.05）;3號方劑中濃度組與模型組相比MDA含量降低了68.4%（P<0.01）、AST含量降低26.8%（P<0.01）、ALT含量降低了25.8%（P<0.05）。結(jié)果表明，體外肝細胞損傷模型建立成功，保肝效果2號方劑高濃度組>1號方劑高濃度組>3號方劑高濃度組>3號方劑中濃度組。

3 討論

肝臟疾病是常見病和多發(fā)病，有著發(fā)病率高、治療難度大、易惡化的特點，是近年來全世界臨床治療的重點和難點。多數(shù)肝疾病共有的病變結(jié)果是肝細胞的損傷，長期的肝損傷會導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化、肝纖維化甚至肝癌[6-7]，所以肝病嚴重威脅人們的身體健康且造成直接經(jīng)濟損失。CCl4致肝損傷經(jīng)典模型常用于快速評價和篩選保肝藥物[8]，當(dāng)CCl4損害肝細胞時不但會增加細胞膜通透性同時改變細胞膜代謝、功能和結(jié)構(gòu)，對機體造成進一步損害[9-10]。當(dāng)肝細胞膜通透性升高，使得ALT和AST大量滲入細胞外液，使得培養(yǎng)基中ALT和AST含量突然大量升高[11-12]。ALT與AST是診斷肝臟疾病最常用的酶，其中ALT被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦為最敏感的肝功能檢測指標(biāo)之一[13]。MDA在體內(nèi)自然生成，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，可對細胞進一步產(chǎn)生破壞作用。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力的降低是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的前提，過氧化肝損傷時肝組織MDA含量增高，MDA含量不僅反映了肝細胞生物膜脂質(zhì)過氧化的程度，還反映了肝臟疾病的嚴重程度，因此可作為評價反映脂質(zhì)過氧化的程度和肝損傷程度的指標(biāo)[14-15]。

本試驗首次對小柴胡湯及其拆方的抗肝細胞損傷效果進行探討分析，采用1.3 mg/mL CCl4培養(yǎng)小鼠肝細胞24 h建立體外肝損模型，通過測定中藥水提物24 h后培養(yǎng)基中ALT、AST、MDA的含量，評價不同濃度的小柴胡湯及其拆方對體外CCl2致肝細胞損傷的保護作用。結(jié)果表明，2號方劑高濃度組（4.2 μg/mL）與其拆方中黃芩（0.2 μg/mL）、柴胡（5.0 μg/mL）水提物可減輕CCl4致肝細胞損傷，培養(yǎng)基中ALT、AST、MDA水平顯著或極顯著降低，有效減輕化學(xué)性毒物所致的肝細胞病理性損傷，對抗化學(xué)性肝損傷具有輔助保護功能，其機制可能與中藥提取物抑制轉(zhuǎn)氨酶、穩(wěn)定細胞膜的結(jié)構(gòu)、抗氧化及清除自由基等作用有關(guān)。本試驗用8 mmol/mL CCl4損傷小鼠肝細胞建立體外肝損模型，在檢測CCl4毒性試驗時，由于CCl4不溶于培養(yǎng)基，采用等體積的DMSO助溶，檢測后設(shè)定可正交試驗需要CCl4的濃度，所以DMSO的毒性試驗只需要檢測需要DMSO濃度的毒性，其結(jié)果表明實驗組與對照組差異不顯著，正交試驗細胞的損傷均由CCl4造成。通過測定給藥24 h后培養(yǎng)基中ALT、AST、MDA的含量，評價不同濃度的小柴胡湯與其拆方對體外CCl4致肝損傷的保護作用。在建模過程使用更少的DMSO助溶，減少了化學(xué)藥物的使用，既節(jié)約了能源又減輕了環(huán)境的負擔(dān)，培養(yǎng)24 h能有效縮短培養(yǎng)時間并能達到相同的試驗?zāi)康?。小柴胡湯與其拆方水提物可減輕CCl4致肝損傷，培養(yǎng)基中ALT、AST、MDA水平顯著降低，有效減輕了化學(xué)性毒物所致的肝組織病理損傷，對化學(xué)性肝損傷具有輔助保護功能，其作用機制與抑制轉(zhuǎn)氨酶穩(wěn)定細胞膜的結(jié)構(gòu)、抗氧化、清除自由基等作用有關(guān)。

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