趙光輝 方洪楓 陳劍 陳躬國(guó) 林原 袁濱

摘要：旨在借助分子標(biāo)記手段對(duì)草菇菌株進(jìn)行鑒別。利用17條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱ISSR）引物對(duì)20株草菇菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析草菇菌株的遺傳差異。結(jié)果表明，17條引物共擴(kuò)增出123條清晰的DNA片段，其大小為250～2 000 bp，其中多態(tài)性片段92條，平均多態(tài)性位點(diǎn)占比為74.80%。DNA電泳結(jié)果表明，所有供試菌株間的DNA指紋均存在差異。

關(guān)鍵詞：草菇;菌株;分子標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S646.1+303.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0194-03

草菇[Volvariella volvacea （Bull.ex Fr.） Sing.]別稱苞腳菇、蘭花菇、麻菇、貢菇、稈菇、中國(guó)菇等，是一種喜溫、喜濕、自然發(fā)生于稻草上的草腐真菌，因而得名。草菇原產(chǎn)于我國(guó)熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)各地都有栽培。草菇栽培原料廣泛，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[1-4]，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。草菇屬于高溫型菌類，栽培原料及栽培方式多樣化，但是由于低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)等原因，制約了草菇的發(fā)展。真菌的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)方法及分子標(biāo)記方法等，草菇的形態(tài)學(xué)區(qū)別不大，而分子標(biāo)記鑒定可以克服形態(tài)學(xué)鑒別的不足。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，如序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（sequence charactered amplified region，簡(jiǎn)稱SCAR）簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱ISSR）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）等分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到鮑魚(yú)菇、草菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、雙孢蘑菇、黑木耳、野生蘑菇等食用菌遺傳多樣性、品種鑒定和育種研究中[5-20]。ISSR、RAPD這2種分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于食用菌的遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化等研究中。本研究對(duì)收集的20株草菇菌株進(jìn)行ISSR、RAPD遺傳多樣性分析，旨在為草菇鑒定及育種提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

20株試驗(yàn)菌株見(jiàn)表1，均保藏于福建省食用菌種質(zhì)資源保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB）抽提液：2% CTAB（50～100 mg/L），100 mmoL/L Tris-HCl，pH值 8.0;20 mmoL/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，簡(jiǎn)稱EDTA）;Bio-Rad C1000 PCR儀;DYY-12型電泳儀，北京六一儀器廠;GL-20G-Ⅱ 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 草菇菌絲體的制備

將草菇馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）試管菌種接種在PDA液體培養(yǎng)基中，35 ℃搖床培養(yǎng)8 d，收集菌絲，稱取1 g菌絲用濾紙包好，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA的提取

取1 g菌絲放入研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)入7 mL離心管中，用CTAB法提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?，具體操作參考熊芳等的試驗(yàn)方法[5-6]。

1.5 PCR擴(kuò)增

供試的RAPD、ISSR引物序列參照江玉姬等的研究[7]。RAPD、ISSR這2種標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系組分見(jiàn)表2。RAPD PCR程序設(shè)定如下：94 ℃預(yù)變性 7 min;94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。ISSR PCR程序設(shè)定如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。電泳擴(kuò)增方法：取 10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，保持160 V恒壓，電泳時(shí)間為1.5 h，通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.6 聚類分析

根據(jù)電泳圖上的擴(kuò)增片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有相應(yīng)多態(tài)性條帶的記為“1”，無(wú)相應(yīng)多態(tài)性條帶的記為“0”，將統(tǒng)計(jì)形成的“0-1”數(shù)據(jù)表輸入NTSYS-PC V2.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件中，采用平均連鎖法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，生成遺傳聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增全模板電泳結(jié)果

選用17條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的RAPD、ISSR引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DNA指紋圖譜（圖1、圖2）?？梢钥闯?，每個(gè)引物對(duì)不同菌株擴(kuò)增得到的DNA條帶數(shù)不等，一般為3～13個(gè)，絕大多數(shù)擴(kuò)增片段大小為200～2 000 bp;部分?jǐn)U增產(chǎn)物片段為所有菌株共有，說(shuō)明草菇菌株基因組的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)比較保守，該區(qū)域可作為草菇菌株物種特征遺傳信息。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

采用17條引物對(duì)20個(gè)草菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，17條引物均能擴(kuò)增出穩(wěn)定性強(qiáng)、可重復(fù)性高且多態(tài)性豐富的帶型。由表3可見(jiàn)，不同引物所擴(kuò)增條帶的多態(tài)性頻率不同，引物S227、S380、S1010、811、864、868所擴(kuò)增條帶的多態(tài)性位點(diǎn)頻率均達(dá)到100.00%，17條引物所擴(kuò)增條帶的平均多態(tài)性頻率為73.18%。另外，由17條隨機(jī)引物擴(kuò)增得到的共123個(gè)RAPD、ISSR位點(diǎn)中，有92個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，其多態(tài)性頻率為74.80%。試驗(yàn)結(jié)果表明，草菇菌株之間具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 基于RAPD、ISSR的系統(tǒng)綜合聚類結(jié)果

通過(guò)NTSYS-PC聚類分析軟件分析得出，草菇菌株之間的遺傳多樣性比較豐富。此外，借助RAPD、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以將20株菌株完全區(qū)分開(kāi)。由圖3可以看出，親緣關(guān)系較近的菌株有13號(hào)、20號(hào);11號(hào)草菇（上海草菇）菌株與其他草菇菌株之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在相似系數(shù)為0.21左右處，可以將20株菌株分為13類;有11株菌株為單獨(dú)的1類，分別為1、7、8、5、10、14、15、19、18、17、11號(hào)菌株;第12類為2、9號(hào)菌株;第13類為3、4、6、16、12、13、20號(hào)菌株。

3 討論

草菇是我國(guó)重要的食用菌品種之一，屬于高溫菌，目前對(duì)草菇遺傳物質(zhì)的研究尚較少。草菇是初級(jí)同宗結(jié)合的食用菌，與其他食用菌相比，其有性后代存在更加廣泛的遺傳變異。余志晟等利用RFLP、RAPD方法對(duì)國(guó)內(nèi)12株草菇栽培菌株進(jìn)行分析，結(jié)果表明，菌株間的平均相似系數(shù)為0.707[17];江玉姬等利用RAPD、ISSR、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）3種分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的74株草菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，菌株之間的相似系數(shù)范圍為0～0.79，具有較豐富的遺傳多樣性[7]。韋仕巖等借助篩選到的9個(gè)ISSR引物對(duì)17株草菇菌株基因組DNA進(jìn)行了遺傳差異分析，結(jié)果表明，草菇菌株之間的相似系數(shù)為0.63～0.95[18]。

4 結(jié)論

本研究選用17條多態(tài)性高、分辨率強(qiáng)的RAPD、ISSR引物對(duì)收集到的20份草菇種質(zhì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，草菇RAPD、ISSR帶型表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，多態(tài)性帶型占74.80%?？梢?jiàn)草菇菌株之間雖然存在差異性，但是差異較小，缺少差異性較大的資源，因此今后應(yīng)加強(qiáng)草菇種質(zhì)資源的挖掘。本研究結(jié)果為草菇菌株聚類分析及品種選育提供了分子水平的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃 毅. 食用菌栽培[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2008：10-22.

[2]鄧優(yōu)錦，朱 堅(jiān)，謝寶貴. 圖說(shuō)草菇栽培關(guān)鍵技術(shù)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：6-9.

[3]張樹(shù)庭. 草菇[M]. 香港：香港中文大學(xué)出版社，1975：17-19.

[4]羅貴倫. 草菇的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[J]. 四川食品工業(yè)科技，1995（3）：49-53.

[5]熊 芳，鄭閩江，劉新銳，等. 鮑魚(yú)菇種質(zhì)資源SCAR標(biāo)記的建立及其初步應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（11）：330-335.

[6]傅俊生，劉新銳，謝寶貴，等. 草菇SCAR遺傳標(biāo)記建立及其雜種鑒定應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（17）：41-46.

[7]江玉姬，鄧優(yōu)錦. 74株草菇遺傳多樣性分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（11）：2084-2092.

[8]龔利娟，李 玉，劉淑艷. 香菇品種遺傳多樣性RAPD分子標(biāo)記的研究[J]. 菌物研究，2005，3（1）：17-21.

[9]王秀全，江玉姬，劉維俠，等. 利用RAPD標(biāo)記金針菇的親緣關(guān)系研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2005，24（增刊1）：142-146.

[10]辜運(yùn)富，張小平，陳強(qiáng)袁，等. 雙孢蘑菇種內(nèi)多態(tài)性的AFLP分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，16（4）：39-43.

[11]黃晨陽(yáng)，張金霞，鄭素月，等. 刺芹側(cè)耳rDNA的IGS2多樣性分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（5）：592-595.

[12]唐利華，肖 揚(yáng)，邊銀丙. 中國(guó)黑木耳主要栽培菌株ISSR指紋分析及SCAR標(biāo)記[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2008，27（2）：243-251.

[13]陳美元，廖劍華，王 波，等. 中國(guó)野生蘑菇屬90個(gè)菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2009，16（1）：11-16.

[14]任廣明，李鎮(zhèn)華，郭 興，等. 黑木耳栽培菌株親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39（5）：99-101.

[15]呂長(zhǎng)武，呂 杰，陳恒雷，等. RAPD分子標(biāo)記在食用菌研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2006，26（1）：77-80.

[16]馮偉林，蔡為明. ISSR分子標(biāo)記分析杏鮑菇菌株的遺傳并差異研究[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28（1）：47-49.

[17]余志晟，呂作周. 草菇栽培菌株DNA多態(tài)性PCR-RFLP和RAPD分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（6）：58-62.

[18]韋仕巖，吳圣進(jìn). 草菇菌株的ISSR遺傳差異分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（11）：2209-2213.

[19]孫 勇，林芳燦. 中國(guó)香菇自然種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 菌物系統(tǒng)，2003，22（3）：387-393.

[20]邊銀丙，宋小亞. 幾種新型DNA分析標(biāo)記及其在食用菌研究中的應(yīng)用[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2006，13（1）：78-81.