趙園園 孟金柱

摘要：表皮內干細胞因子（stem cell factor，簡稱SCF）是由角化細胞合成并分泌到細胞間隙，參與黑色素細胞存活、增殖和黑色素生成。為確定黑色素細胞能否合成SCF，分離培養(yǎng)綿羊的皮膚黑色素細胞，并運用免疫熒光技術對黑色素細胞內SCF進行檢測，結果顯示，分離培養(yǎng)的黑色素細胞特征明顯，且在黑色素細胞中檢測到存在SCF蛋白。據(jù)此可以推測黑色素細胞也能合成SCF，它在黑色素細胞存活、增殖和黑色素生成中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：綿羊;黑色素;形態(tài)特征;干細胞因子（SCF）;表達定位

中圖分類號：S826.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0079-03

干細胞因子（stem cell factor，簡稱SCF）又被稱為肥大細胞因子或c-kit配體，是一種膜錨定的非共價結合二聚體，通過與c-kit受體結合進行信號轉導，是造血干細胞、生殖細胞、黑色素細胞和肥大細胞遷移、存活和增殖所必需的[1]。SCF mRNA通過選擇性剪接形成2個不同的跨膜前體，可對細胞表面蛋白酶的敏感性進行區(qū)分。較大的剪接變異體（SCF-M1）包含1個蛋白水解位點，可迅速產(chǎn)生可溶性SCF蛋白（S-SCF），而較小的剪接變異體（SCF-M2）缺乏這個蛋白水解位點，可形成膜結合形式SCF蛋白（M-SCF）。然而，較小的剪接變異體的替代水解位點也會被加工，但效率很低。S-SCF調控黑色素前體細胞的遷移，相對地，M-SCF向表皮的黑色素細胞傳遞導向、存活和增殖信號[2]。

先前的研究表明，表皮SCF是由角化細胞衍生形成的，通過與黑色素細胞膜上的c-kit結合影響黑色素細胞的存活、遷移和增殖以及黑色素合成[3]。為明確SCF在黑色素細胞中的表達部位，本研究分離培養(yǎng)綿羊黑色素細胞，并用免疫熒光對綿羊皮膚黑色素細胞中的SCF蛋白的表達進行定位研究，以期為進一步研究其在黑色素細胞存活、增殖及色素生成中的作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗以1歲齡黑白花綿羊為研究對象，用取皮器取黑色皮膚（直徑約1 mm）進行黑色素細胞的分離。

1.2 皮膚黑色素細胞的分離培養(yǎng)

在超凈工作臺中，將綿羊皮膚放入75%酒精中浸泡約10 min，用含雙抗（青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3～5次，將皮膚組織剪成2 mm×2 mm的小塊，真皮朝下放入無菌培養(yǎng)皿中，加入0.05% Dispase Ⅱ酶 10 mL，4 ℃下消化16 h，采用眼科鑷分離開真皮和表皮，將表皮放入0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，室溫下孵育5 min，隨后加入等體積含10% FBS的培養(yǎng)基終止消化，轉入細胞培養(yǎng)箱中（含5% CO2）孵育1 h，反復吹打，形成黑色素細胞懸液，采用200目細胞篩進行過濾，收集過濾液，低速冷凍離心（1 000 r/min，4 ℃），棄上清，加入 2 mL 含雙抗和生長因子的MELM（ScienCell）培養(yǎng)基，然后進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度至5×104個/mL，轉移至六孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入 1 mL 細胞懸液，再加入等體積的細胞培養(yǎng)基，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng) 48 h，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長至約80%進行傳代培養(yǎng)。細胞傳代時使用0.25%胰蛋白酶進行消化。

1.3 免疫熒光

對濃度達到約80%的細胞進行傳代培養(yǎng)，將其轉移至鋪有蓋玻片的細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至濃度約為80%時，去掉培養(yǎng)基，用PBS洗3次。取出附著有細胞的蓋玻片，注意不要觸碰到細胞，加入4%多聚甲醛冰上固定 15 min，用PBS洗3次，每次3 min，往載玻片上滴加0.5% Triton X-100，以覆蓋全部細胞為宜，室溫孵育20 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加山羊血清，室溫封閉30 min，用PBS洗3次，滴加SCF抗體（一抗，ab64677，abcam，1 ∶ 200 稀釋）稀釋液，以滴加PBS為對照組，放入溫盒中，4 ℃過夜孵育第2天取出，在室溫下復溫 30 min，用PBST（PBS溶液加Tween-20）洗3次，每次3 min，滴加鏈霉素和素-生物素-過氧化物酶復合物-異硫氰酸熒光素（SABC-FITC）（山羊IgG）（熒光二抗，1 ∶ 100，博士德）37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，吸干水，用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡藍光激發(fā)熒光下觀察、采集圖像。

2 結果與分析

2.1 綿羊皮膚黑色素細胞的形態(tài)特征觀察

對分離培養(yǎng)的第3代綿羊黑色素細胞進行形態(tài)學觀察，結果（圖1）發(fā)現(xiàn)，綿羊黑色素細胞生長較快，排列緊密，呈鵝卵石狀排列，細胞有突起，突起數(shù)量為1～3個，細胞排列密集時，突起較少，而分布稀疏部位的細胞突起較多且明顯。

2.2 綿羊皮膚黑色素細胞中SCF的表達定位

通過免疫熒光技術對綿羊皮膚黑色素細胞中的SCF蛋白進行檢測，由圖2可知，SCF蛋白可在綿羊黑色素細胞中表達，主要分布在細胞質中，尤其是細胞核的周圍。

3 討論

對黑色素細胞的分離多采用酶消化法，主要有Dispase Ⅱ酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶獨立消化法，因胰蛋白酶對細胞的損傷作用較明顯，本

研究采用Dispase Ⅱ酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法來分離綿羊皮膚的黑色素細胞。白瑞等發(fā)現(xiàn)，Dispase Ⅱ酶處理組收集的黑素細胞明顯多于其他組，說明Dispase Ⅱ酶能更好地分離皮膚，并且能更完全地摧毀皮膚的基底層，使黑色素細胞更完全地暴露出來，便于收集到更多的黑色素細胞，同時，由于胰蛋白酶的處理時間縮短，大大降低了對細胞的損傷，使細胞活性和生長狀態(tài)更好[4]。牛牧采用酶消化法聯(lián)合組織塊法對人的皮膚黑色素細胞進行分離，發(fā)現(xiàn)原代細胞的數(shù)量雖然稍少，但細胞樹突較多、交織成網(wǎng)、貼壁良好[5]。本研究獲得的黑色素細胞形態(tài)、結構與先前的研究[6-7]相符合。

SCF/c-kit信號通路在黑色素細胞中能誘導小眼畸形相關轉錄因子（MITF）和酪氨酸相關蛋白酶1（TYRP1）的轉錄，TYRP1是酪氨酸酶（TYR）家族成員之一，該家族能直接催化黑色素的生成，而MITF通過與該基因家族的啟動子結合促進其表達，從而促進黑色素合成[8-11]。本研究結果顯示，SCF在黑色素細胞中存在，這為研究SCF在黑色素細胞中的功能提供了新方向。另外，SCF在細胞核周圍區(qū)域分布豐富，這可能是由于基因在細胞核內轉錄，細胞質中翻譯成蛋白質。

4 結論

本研究成功分離培養(yǎng)綿羊黑色素細胞，觀察發(fā)現(xiàn)，細胞特征明顯。SCF可在黑色素細胞中表達，且集中表達區(qū)域為細胞核的周圍。

參考文獻：

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