郝露露,雷文平,劉成國,戴智勇,張巖春,汪家琦,汪鎮(zhèn)南,周 輝,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128;2.澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司,湖南長沙 410200;3.湖南沙博安科技有限公司,湖南長沙 410200)

益生菌是可以在體內(nèi)生存,且生長到一定數(shù)量時可有助于宿主健康的一類微生物[1]。目前,研究較多的益生菌為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬,其中乳桿菌屬是人體腸道以及口腔內(nèi)部最常見的共生菌群,可以有效地抑制腸道內(nèi)有害菌的生長,已被確定為具有應(yīng)用價值的益生菌[2-3]。益生菌用于乳酸菌發(fā)酵飲料和食物已經(jīng)有幾千年的歷史,說明了益生菌是安全的食品級微生物[4]。近年來,益生菌的研究越來越受關(guān)注,在篩選出具有應(yīng)用前景的益生菌時需要考慮很多因素,例如菌株對胃腸道低酸環(huán)境的耐受性能力,如果益生菌不能夠順利地在人體小腸內(nèi)進行定植,就無法發(fā)揮其益生作用[5]。研究益生菌的體內(nèi)活性成本高且費時,所以人們一般采取體外實驗研究其益生活性,并且,每一個菌株都必須進行相關(guān)特性的體外評價,因為不同的益生菌株之間存在著相當(dāng)大的差異性[6]。

發(fā)酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉為原料,經(jīng)過殺菌,發(fā)酵后pH降低的一類產(chǎn)品。在眾多乳制品中,發(fā)酵乳被認為是將益生菌傳遞到人體內(nèi)的最理想載體,添加益生菌后可以將菌種本身的保健作用與發(fā)酵乳的健康功效完美結(jié)合起來[7],因此,目前關(guān)于功能性益生菌的研究受到了越來越多的關(guān)注[8]。本研究采用體外益生特性篩選的方法從4株植物乳桿菌中篩選得到1株益生特性較好的植物乳桿菌,并研究其作為輔助發(fā)酵劑的發(fā)酵特性,期望在功能性乳品中得到開發(fā)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌B14、C24、XC2、32E、大腸桿菌CGMCC9181、單增李斯特菌54002 均為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院乳制品功能實驗室保存;MRS肉湯培養(yǎng)基、生物胺試劑盒、血平板、革蘭氏染色液試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;抗菌藥物藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司;胰蛋白酶(酶活力 50000 U/g) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶(酶活力：3500 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;其它試劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化及菌懸液的制備 菌株活化:取-80 ℃保藏的菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,活化兩代后在含1%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上劃線,挑取有溶鈣圈平板上的單菌落進行培養(yǎng)備用。菌懸液的制備:將培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液10 mL于8000 r/min離心5 min,用0.85%生理鹽水洗滌兩次后,重懸,制成菌懸液備用[9]。

1.2.2 自聚集、共聚集試驗 自聚集:參照趙維俊等[10]的方法,取1 mL菌懸液到1.5 mL的EP管中,旋渦10 s后靜置5 h,取上清液測定600 nm處的吸光度值(LGG作為對照),每一株菌做3組平行實驗,取平均值記錄結(jié)果。計算公式如下:

式中:A1為5 h后菌種上清液在600 nm處的吸光度值;A0為靜置前菌種上清液在600 nm處的吸光度值。

共聚集:取0.5 mL的菌株菌懸液加入1.5 mL的EP管內(nèi),加入0.5 mL的指示菌的菌懸液后,靜置5 h,取上清液測定600 nm處的吸光度值(LGG作為對照),每一株菌做3組平行實驗,取平均值記錄結(jié)果。計算公式如下:

式中:A1為5 h后菌種上清液在600 nm處的吸光度值；A2為指示菌靜置5 h后上清液在600 nm處的吸光度值;A1+2為指示菌和實驗菌株混合靜置5 h上清液在600 nm處的吸光度值。

目前秦淮河水質(zhì)改善以引江換水為主體，在豐水期降水較多時，可利用降雨徑流及上游來水對外秦淮河補水；在長江水位高于秦淮新河水位時，實施長江自流引水；在不滿足以上條件下實施翻水，利用秦淮新河抽水站抽引長江水入秦淮河?？菟诤推剿?，上游水量較小，長江水位也較低，不能實現(xiàn)自流，則繼續(xù)采用秦淮新河站抽引江水入秦淮河。

1.2.3 疏水性試驗 參照Burns等[11]的方法,分別取2 mL菌懸液于3支5 mL離心管中,依次加入2 mL二甲苯、十六烷和乙酸乙酯,渦旋振蕩2 min,于通風(fēng)廚靜置30 min,測定水相吸光值A(chǔ)1,每組平行測定3次(LGG作為對照),計算公式如下:

式中:A0是菌懸液在波長600 nm的初始吸光度值,A1是靜置30 min后的吸光度值。

1.2.4 模擬胃腸液試驗 人工胃液和腸液參照婁利嬌等[12]的方法配制,人工胃液:配制pH為3.0的溶液,量取1 mol/L HCl 20 mL,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為3.0,加入胃蛋白酶并溶解,使其質(zhì)量濃度為1 g/100 mL。采用0.22 μm微孔濾膜除菌,制得人工胃液備用。人工腸液:取磷酸二氫鉀6.8 g,加水500 mL使溶解,用40%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至6.8,另取胰蛋白酶10 g,加水適量使溶解,將兩液混合后,加水稀釋至1000 mL,用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,制得人工腸液備用。

參照楊靜等[13]的方法,并稍作改動,取0.5 mL菌懸液加入到4.5 mL模擬胃液和腸液中,混合均勻,37 ℃培養(yǎng)3 h。分別于0 h和3 h取出培養(yǎng)液并做適當(dāng)稀釋涂布,37 ℃培養(yǎng)48 h,測定活菌數(shù),計算存活率(%)(LGG作為對照)。

1.2.5 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)[14]進行藥敏試驗。

1.2.6 溶血性試驗 將實驗菌株培養(yǎng)24 h后點種于血瓊脂培養(yǎng)基上,每株菌在同一個平板上點種3次,然后在37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察是否有溶血現(xiàn)象產(chǎn)生。以金黃色葡萄球菌作為陽性對照。

1.2.7 生物胺試驗 取0.5 mL的菌懸液加入到賴氨酸脫羧酶和氨基酸脫酸酶對照的試劑瓶中,并加入0.5 mL的液體石蠟后放入培養(yǎng)箱中,48 h后觀察實驗結(jié)果。

1.2.8 黏附試驗 細胞培養(yǎng):取凍藏的Caco-2細胞復(fù)蘇,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中,加入DMEM完全培養(yǎng)液,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),每隔2 d換液一次,當(dāng)細胞的融合度達到 70%～80%時,進行傳代培養(yǎng)[15]。參照Nueno-Palop等[16]的方法進行菌株B14的黏附試驗,計算公式如下:

1.2.9 發(fā)酵特性的研究

1.2.9.1 菌株的馴化 將B14培養(yǎng)液和脫脂乳培養(yǎng)基按照1∶1的比例混合培養(yǎng),得到接種脫脂乳,37 ℃培養(yǎng)24 h,之后每次馴化逐步增加脫脂乳培養(yǎng)基的用量,減少MRS培養(yǎng)基的用量,直至MRS培養(yǎng)基添加量為零時馴化完成。

1.2.9.2 發(fā)酵乳的制備 稱取質(zhì)量分數(shù)為12%的脫脂乳溶于蒸餾水中,95 ℃滅菌5 min,冷卻,商業(yè)發(fā)酵劑和菌株B14分別按照3%的添加量添加到發(fā)酵乳中,然后分裝發(fā)酵。分別在發(fā)酵0、3、9、12、24 h時測定其發(fā)酵乳的黏度、pH和滴定酸。

1.2.9.3 黏度的測定 將發(fā)酵乳置于室溫(25 ℃)一段時間后,采用數(shù)顯黏度測定儀測定發(fā)酵乳的黏度，3號轉(zhuǎn)子進行測定,測定時間30 s,每個樣品平行測定3次。

1.2.9.4 發(fā)酵乳pH和滴定酸的測定 pH的測定:采用數(shù)顯pH計測定發(fā)酵乳的pH。每個樣品平行測定3次。滴定酸的測定:按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB-5009.239-2016食品酸度的測定方法進行測定,每個樣品平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,試驗數(shù)據(jù)由Excel 2010、origin 2018和DPS數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件計算處理,用T-檢驗進行分析,P<0.05認為是有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 自聚集、共聚集的試驗結(jié)果

自動聚集能力是指菌體在培養(yǎng)過程中,大量并快速的繁殖從而導(dǎo)致其自行成團的現(xiàn)象[17]。4株乳酸菌的自聚集能力如圖1所示,其中,菌株B14與其它菌株呈現(xiàn)出顯著差異,菌株B14的自聚集能力達到85.582%±2.363%。4株菌株和LGG與致病菌共聚集能力如圖2所示,所有待試菌株與致病性大腸桿菌、單增李斯特菌的共聚集能力均較強。其中,菌株B14與致病性大腸桿菌和單增李斯特的共聚集能力分別為74.681%±1.856%、76.248%±1.361%,均高于對照菌株LGG,且與其它菌株(除32E)具有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 4株植物乳桿菌的自聚集能力

圖2 4株植物乳桿菌的共聚集能力

2.2 菌株的疏水性結(jié)果

益生菌疏水性的大小可以初步反映其對腸道上皮細胞的黏附力的大小[18]。細菌的表面疏水性與粘附能力呈正相關(guān)性,通過對疏水性的研究可篩選出潛在的高黏附性菌株[19]。本實驗中采用二甲苯、乙酸乙酯和十六烷檢測表面疏水性,4株菌對這三種有機溶劑的疏水能力如圖3所示,菌株間的疏水性存在著較大的差異,每株乳酸菌對不同的有機溶劑的表面疏水性也存在著差異,菌株B14對三種有機溶劑均表現(xiàn)出較高的疏水性,其中,對乙酸乙酯的疏水率達到62.146%±2.959%,對二甲苯的疏水率達到88.419%±5.319%,對十六烷的疏水率達到81.864%±4.426%,與其它菌株相比,具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 4株植物乳桿菌的疏水性

2.3 模擬胃腸液的試驗結(jié)果

益生菌在進入腸道之前要先經(jīng)過胃部,因此耐受胃液能力是益生菌篩選的重要指標(biāo)[20]。研究表明,在pH1.5的環(huán)境中,多數(shù)乳酸菌在1 h后死亡;在pH2.5～4.0環(huán)境中,大多數(shù)乳酸菌在3 h內(nèi)仍保持較高的存活力[21-22]。因此,本研究采用pH3.0的人工模擬胃液評價菌株的胃液耐受能力。由圖4可知,除菌株XC2外,菌株32E、B14、C24具有很強的耐受胃液能力,3 h內(nèi)存活率均達到80%以上。

圖4 4株植物乳桿菌的人工胃腸液存活率

乳酸菌經(jīng)過胃部后,最后要在腸道定植后才能發(fā)揮其益生特性[23]。在人工模擬腸液試驗中,4株菌均具有很強的耐受腸液能力,3 h內(nèi)對照菌株LGG存活率達到116%,實驗菌株均達到100%以上的存活率。徐致遠[24]對植物乳桿菌ST-Ⅲ在模擬胃腸液的存活率進行研究,3 h存活率達到100%以上,可能因為人工胃腸液在此pH條件下對菌株生長影響不大,實驗菌株是處于對數(shù)生長期的旺盛菌株。本試驗所用的4株菌株均具有較強的胃腸液耐受能力,可以順利通過胃液進入腸道發(fā)揮其益生作用。

2.4 菌株的藥敏試驗結(jié)果

采用K-B法測定4株菌株對20種不同的抗生素的敏感度,各試驗菌株對不同抗生素的敏感性存在差異,結(jié)果如表1所示,一般對卡芐西林、四環(huán)素、紅霉素、青霉素、頭孢類等大多數(shù)抗生素敏感,但對慶大霉素、卡那霉素和新霉素的敏感性較弱。細菌耐藥性一般分為固有耐藥性和獲得性耐藥性,因此細菌對某些藥物具有耐藥性也是不可避免的[25]。

表1 4株植物乳桿菌對不同抗生素的敏感度

2.5 菌株的溶血性及生物胺試驗結(jié)果

4株菌株對血平板未產(chǎn)生任何溶血現(xiàn)象,生物胺對照試驗表明,4株菌均不產(chǎn)生物胺,試驗結(jié)果如表2所示。

表2 4株植物乳桿菌的溶血性和產(chǎn)生物胺試驗結(jié)果

通過自聚集、共聚集、疏水性和模擬胃腸液等一系列試驗的篩選,在4株植物乳桿菌中,B14表現(xiàn)出良好的益生特性,與其它菌株相比具有顯著性差異,因此選用菌株B14進行黏附試驗和發(fā)酵特性的研究。

2.6 菌株B14的黏附試驗結(jié)果

益生菌與腸道表面的黏附和人胃腸道的定殖是益生菌作用的重要前提[26]。Caco-2細胞是一種人克隆結(jié)腸腺癌細胞,結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞,可以較好的模擬人體腸道中的環(huán)境[27]。占萌[28]研究發(fā)現(xiàn),影響細胞黏附的因素有很多,包括菌株濃度、生長階段、表層蛋白等。本試驗中,植物乳桿菌B14的黏附率為30.756%,高于對照菌株LGG,這一結(jié)果可能與菌株濃度、菌株生長階段、表層蛋白等多種因素有關(guān),可以看出B14具有定植腸道的潛在能力。

圖5 植物乳桿菌B14對Caco-2細胞的黏附能力

2.7 菌株B14的發(fā)酵特性結(jié)果

2.7.1 發(fā)酵乳黏度隨時間變化曲線 菌株B14、發(fā)酵劑和混合發(fā)酵在24 h內(nèi)黏度值的變化如圖6所示,植物乳桿菌B14在脫脂乳發(fā)酵12 h時黏度才大幅增長,12 h之前產(chǎn)黏能力較差,而菌株B14和發(fā)酵劑共同發(fā)酵時,產(chǎn)黏能力比單獨發(fā)酵劑發(fā)酵時的效果好,發(fā)酵24 h時,混合發(fā)酵黏度達到4556.333 mPa·s,由此可得出,菌株B14可輔助商業(yè)發(fā)酵劑提高脫脂乳發(fā)酵過程中的黏度。

圖6 不同發(fā)酵乳在24 h內(nèi)黏度的變化情況

2.7.2 發(fā)酵乳pH隨時間變化曲線 菌株B14、發(fā)酵劑和混合發(fā)酵在24 h內(nèi)pH的變化如圖7所示,脫脂乳經(jīng)植物乳桿菌B14發(fā)酵24 h后測得發(fā)酵pH為4.124,表明植物乳桿菌B14產(chǎn)酸能力較弱,不適合單獨作為發(fā)酵劑制作發(fā)酵乳,但是B14和發(fā)酵劑的混合發(fā)酵pH比單獨發(fā)酵劑的pH下降的快,9 h時混合發(fā)酵的pH達到3.619±0.009,所以B14可以考慮作為輔助發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑進行復(fù)配使用提高發(fā)酵乳的益生功能。

圖7 不同發(fā)酵乳在24 h內(nèi)pH的變化情況

2.7.3 發(fā)酵乳滴定酸隨時間變化曲線 菌株B14、發(fā)酵劑和混合發(fā)酵在24 h內(nèi)滴定酸的變化如圖8所示,三種發(fā)酵液的酸度隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸升高,當(dāng)發(fā)酵24 h時,植物乳桿菌B14的酸度達到80.682±5.255 °T,發(fā)酵劑的酸度值為110.704±4.164 °T,而B14和商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵的酸度達到了114.858±2.665 °T,效果最佳。因此,可以考慮植物乳桿菌B14作為輔助發(fā)酵劑和商業(yè)發(fā)酵劑共同發(fā)酵脫脂乳。

圖8 不同發(fā)酵乳在24 h內(nèi)滴定酸的變化情況

3 結(jié)論

本研究從實驗室4株植物乳桿菌中篩選出益生特性較好的菌株B14,該菌對二甲苯和十六烷的疏水性均達到80%以上,自聚集能力超過85%,共聚集能力超過75%,細胞黏附率達到30.756%,與其它菌株相比具有更好的益生特性。在進一步的發(fā)酵特性的研究中,植物乳桿菌B14作為輔助發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳中,在發(fā)酵24 h內(nèi),黏度、滴定酸均得到了相應(yīng)的提高。研究結(jié)果為植物乳桿菌B14作為益生性發(fā)酵菌株的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。