余 芳，鄭 萍，劉晴晴

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 a.健康學(xué)院; b.江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 南京 211168)

烏飯樹是杜鵑花科越橘屬植物，又名南燭、烏飯子、染菽等，廣泛分布于長江以南各地區(qū)，多生長在山坡灌木叢或馬尾松林內(nèi)，屬杜鵑花科四季常綠的灌木，其葉子為卵形或橢圓形，秋季開白色花，其漿果為球狀，熟時(shí)呈紫黑色，味甜可食。每年陰歷四月初八，南京地區(qū)有用烏飯樹葉打成汁水浸泡大米、煮烏米飯食用的傳統(tǒng)。唐代陸龜蒙在《道室書事》中有“烏飯新炊筆服香，道家齋日以為?！敝Z。明代《正德江寧縣志》卷2記載：“四月八日吱烏飯?！崩顣r(shí)珍在《本草綱目》中稱：“烏飯乃仙家服食之法?！睘躏垬淙~全緣或有鋸齒狀，表面平坦有光澤，味苦、平、無毒。清代《本草新編》中記載，烏飯葉“益精氣，強(qiáng)筋骨，明目，止泄”，是重要的藥材，具有抗衰老、抗炎癥、改善血液循環(huán)等多種藥理功效。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，烏飯枝葉性味苦、平、無毒，止泄除睡，強(qiáng)筋益氣，久服輕身明目，黑發(fā)駐顏，可以調(diào)補(bǔ)脾腎、舒筋活絡(luò)、助陽補(bǔ)陰，日常食用對(duì)人體有一定的益處。烏飯葉中含有多酚類物質(zhì)、黃酮、熊果酸、β-谷甾醇、藍(lán)黑色素、對(duì)羥基桂皮酸、內(nèi)消旋肌醇、α-亞麻酸以及鈣、鉀、鋅、鐵、錳、銅、鍶等大量的微量元素。吳鳳桐等從烏飯葉的石油醚提取物中分離鑒定出2種物質(zhì)結(jié)晶：烏索酸(ursolic acid)、齊墩果酸(olanolic acid)。其含有的多酚類物質(zhì)抗氧化能力很強(qiáng)，具有抗疲勞及延緩衰老的作用。α-亞麻酸具有降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、減少血栓的作用，熊果酸有降血糖的作用。

本實(shí)驗(yàn)以新鮮烏飯葉為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探索烏飯葉中多酚類物質(zhì)的提取方法，優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)利用傳統(tǒng)烏飯葉資源提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

烏飯葉，市售當(dāng)年新葉，5月間采于江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所需試劑見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所需試劑

1.3 主要設(shè)備

BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司； SHA-C電熱恒溫水浴鍋，上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JH722可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海精密儀器儀表有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試樣制備

當(dāng)日采摘新鮮烏飯葉，洗凈葉面灰塵后，自然瀝水至葉面無水分殘留，分裝入塑料包裝袋，于冰箱中冷藏備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

酒石酸鐵溶液的配制：準(zhǔn)確稱取1 g硫酸亞鐵和5 g酒石酸鉀鈉，將所稱取固體放入燒杯，加適量蒸餾水溶解，分次轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶，稀釋定容至刻度。

pH 7.5磷酸緩沖液的配制：準(zhǔn)確稱取60.20 g磷酸氫二鈉和5 g磷酸二氫鈉，將所稱取固體放入燒杯，加適量蒸餾水溶解，分次轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶，稀釋定容至刻度。

1.4.3 多酚含量的測定

準(zhǔn)確吸取不同處理?xiàng)l件下提取過濾后獲得的待測液體4 mL(需現(xiàn)配現(xiàn)用)，分別放入100 mL容量瓶，再吸取16 mL蒸餾水、20 mL酒石酸鐵溶液，用磷酸緩沖液定容至刻度線處。同時(shí)做一個(gè)空白樣，準(zhǔn)確吸取20 mL蒸餾水和20 mL酒石酸鐵溶液放入100 mL容量瓶，用磷酸緩沖液定容至刻度線。放置10 min后，將1 cm的玻璃比色杯置于540 nm處，測定其吸光度。根據(jù)吸光度等于1時(shí)，多酚含量為7.826 mg計(jì)算：

多酚(%)=[(A×7.826)/103]×[T/(V×M)]×102

其中：A——樣液的吸光度，T——供試液總量(mL)，V——吸取的樣液量(mL)，M——樣品質(zhì)量(g)。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取烏飯葉10 g，適當(dāng)剪碎，加適量溶劑，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎，待提取多酚類物質(zhì)。通過單因素實(shí)驗(yàn)，考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴提取溫度、提取時(shí)間對(duì)烏飯葉多酚類物質(zhì)得率的影響。

1.5.1 料液比

按照料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間30 min，水浴提取溫度60 ℃，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%，料液比為1∶10，提取時(shí)間為30 min，水浴提取溫度為60 ℃，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.5.3 提取時(shí)間

設(shè)定提取時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比為1∶10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，水浴提取溫度為60 ℃，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.5.4 提取溫度

設(shè)定水浴提取溫度為40、50、60、70、80 ℃，料液比為1∶10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，提取時(shí)間為30 min，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.6 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴提取時(shí)間、提取溫度作為考察的 4個(gè)因素，每因素設(shè)置 3個(gè)水平，進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，確定最佳提取工藝，見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.7 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果均平行重復(fù)3次(n=3)，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.1 料液比對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

如圖1所示：當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，在水浴提取過程中乙醇蒸發(fā)損失，導(dǎo)致可能存在料液比誤差，提取液過濾后獲得的樣液很少，在此過程中由于提取液被濃縮而顯示吸光值虛高；當(dāng)料液比增加到1∶10、1∶20、1∶30、1∶40后，吸光值呈現(xiàn)先增后減的趨勢，1∶40時(shí)已處于下降狀態(tài)，且料液比越大，多酚類物質(zhì)的提取得率越低。因此選擇料液比1∶10、1∶20、1∶30作為正交試驗(yàn)的三個(gè)試驗(yàn)水平。

圖1 料液比對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

如圖2所示：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚類物質(zhì)的溶解度不斷增大，多酚類物質(zhì)得率呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～50%時(shí)，多酚類物質(zhì)的溶解度達(dá)到較高狀態(tài)，60%后呈下降趨勢，溶解度降低。因而選擇乙醇濃度30%、40%、50%作為正交試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)的三個(gè)試驗(yàn)水平。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

由圖3可知，在提取時(shí)間為1.5～2.5 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率直線提升，可見反應(yīng)時(shí)間越長，提取越充分。但考慮提取時(shí)間越長，多酚類物質(zhì)越容易被氧化，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度較大，因此選擇1、1.5、2 h作為正交試驗(yàn)提取時(shí)間的三個(gè)水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

由圖4可知，隨著水浴提取溫度的升高，多酚類物質(zhì)的溶解度不斷增大，多酚類物質(zhì)得率一直處于上升狀態(tài)，但溫度越高，提取溶劑乙醇溶液的蒸發(fā)速度越快，極易造成料液比的誤差和提取液的濃縮，從而導(dǎo)致吸光值虛高。因此選取60、70、80 ℃作為正交試驗(yàn)提取溫度的三個(gè)水平。

圖4 提取溫度對(duì)多酚類物質(zhì)得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳提取條件。以料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。每一水平K1、K2、K3中的最大值所對(duì)應(yīng)的條件即為該因素對(duì)應(yīng)的最佳提取條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，提取烏飯葉中多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件為A1B3C3D3，即料液比1∶10 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、提取時(shí)間2 h、提取溫度 80 ℃。4個(gè)因素對(duì)烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率的影響大小依次為：A>B>C>D。其中料液比A的提取作用最為顯著。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3：

影響烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率的主要因素有液料比、超聲波輔助提取、浸提溫度、浸提時(shí)間和提取次數(shù)等。

余清采用醇提法提取烏飯葉多酚類物質(zhì)，通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝為浸提溫度75 ℃、乙醇濃度50%、固液比1∶40、提取時(shí)間2 h、提取2次。方差分析結(jié)果表明固液比和提取時(shí)間對(duì)多酚類物質(zhì)的提取效果影響極顯著，確證實(shí)驗(yàn)表明該條件下烏飯葉提取液中多酚含量達(dá)11.36%。

王芳等通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化烏飯葉黃酮、多酚的提取工藝。結(jié)果表明，烏飯葉黃酮、多酚的最佳提取工藝條件為提取溶劑50%乙醇，料液比1∶41，提取時(shí)間50 min，提取溫度83 ℃，該條件下黃酮、多酚類物質(zhì)得率分別為33.4、23.5 mg/g。

陳瑞嬌對(duì)烏飯樹葉多酚的超聲波輔助提取最佳工藝及其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，烏飯樹葉多酚超聲波輔助提取最佳工藝條件為超聲溫度75 ℃、超聲時(shí)間40 min、料液比1∶30(g/mL)，在此條件下烏飯樹葉多酚提取量可達(dá)71.01 mg/g。

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)，以料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，得出提取烏飯葉中多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件為：料液比1∶10(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、提取時(shí)間2 h、提取溫度 80 ℃。該試驗(yàn)條件下烏飯葉提取液中的多酚類物質(zhì)得率為13.0%。四個(gè)因素對(duì)烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率的影響大小依次為：A>B>C>D。即料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫度。

4 展望

烏飯樹主要產(chǎn)于我國浙江、江蘇、福建等長江以南地區(qū)。烏飯葉的食用方法以現(xiàn)采鮮食為主。烏飯葉在提取過程中所含有的多酚類物質(zhì)容易氧化，因此不易保存，其綜合利用引起了很多學(xué)者的關(guān)注。肖珊美以烏飯葉為原料，通過浸漬提取汁液、濃縮、制粒、干燥等方法制得顆粒劑保健品。唐旭東等申請(qǐng)了制備烏飯葉茶的專利，將烏飯樹葉蛋白酶解產(chǎn)物與烏飯樹葉茶粉混合、包裝、殺菌，制得降血壓烏飯樹葉袋泡茶產(chǎn)品。邵京等公開了烏飯葉釀制糯米酒的專利，以烏飯葉和糯米為主要原料，經(jīng)過原料預(yù)處理、烏飯葉提取液制備、滅菌、浸米、 煮制、配制、主發(fā)酵、后發(fā)酵、分離，最后制得產(chǎn)品。譚小丹等用烏飯葉制成的防腐物質(zhì)，不僅可用于食品加工之中，還可以作為天然食品添加劑使用。因此，無論是從藥用價(jià)值還是食療保健的角度，烏飯葉研究開發(fā)都具有廣闊的市場應(yīng)用前景，能產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。