王斌, 成亞飛, 武杰, 李剛磊, 王世明

(山西醫(yī)科大學 第一醫(yī)院 普通外科, 山西 太原 030000)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率[1].近年來，盡管隨著肝癌診斷和治療技術的提高，患者預后有了較大改善，但仍有部分患者體內腫瘤易發(fā)生復發(fā)和轉移，極大地威脅著患者健康[2].因此，尋找有效的肝癌治療藥物對于肝癌的治療具有重要意義.三葉青是一種江浙地區(qū)傳統(tǒng)的中藥，主要活性成分包括黃酮、多糖、山奈酚等，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等生物學功效[3-5].三葉青根多糖(polysaccharides from roots ofRadixTetrastigma，RTP)是從三葉青塊根中提取得到的多糖，研究顯示，其可抑制胃癌細胞的增殖，誘導癌細胞凋亡[6].目前，三葉青根多糖對肝癌細胞生物學行為的影響還尚未可知，故本研究以肝癌細胞HepG2為研究對象，探討三葉青根多糖對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能的作用機制，以期為肝癌治療藥物的研發(fā)提供一定的新方向.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

肝細胞L-02購自上海研謹生物科技有限公司；肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫；三葉青根購自上饒市紅日農業(yè)發(fā)展有限公司，三葉青根多糖參照文獻[7]方法提?。惶ヅＱ?FBS)購自浙江天杭生物科技股有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶和噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海復申生物科技有限公司；miR-151模擬物(mimics)及陰性對照(miR-NC)、miR-151抑制劑(anti-miR-151)和陰性對照序列(anti-miR-NC)購自上海GenePharma公司；PCR引物序列購自上海生工生物工程公司；鼠抗人P21、CyclinD1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗人Bcl-2、鼠抗人Bax單克隆抗體購自北京中山生物技術有限公司；鼠抗人MMP2、Ecadherin單克隆抗體購自美國ZYMED公司.

VICTOR Nivo型酶標儀購自美國PerkinElmer公司，FACS Calibur型流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司，ZF-258型凝膠成像系統(tǒng)購自上海嘉鵬科技有限公司，ABI 7500型Realtime PCR儀購自美國Applied Biosystems公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

肝細胞L-02和肝癌細胞HepG2培養(yǎng)方法相同，均用含體積分數10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當細胞生長匯合度達80%左右時，胰蛋白酶消化，以1∶3比例進行傳代培養(yǎng).

1.2.2 篩選RTP作用的質量濃度和時間

取對數生長期的肝細胞L-02和肝癌細胞HepG2，調整密度為2.5×104/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL.肝細胞L-02分為對照組(Con組)和不同質量濃度的RTP組，Con組細胞用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同質量濃度的RTP組細胞分別用含質量濃度為0.65、1.25、2.5、5、7.5、10 mg/mL RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)[6].分別培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT檢測肝細胞L-02增殖情況，以RTP組與Con組細胞吸光度值比較無統(tǒng)計學差異表示此質量濃度的RTP對肝細胞L-02無毒性，篩選出對肝細胞L-02無毒性的RTP質量濃度.HepG2細胞分為Con組和RTP組，Con組細胞用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，RTP組細胞加入對肝細胞L-02無毒性質量濃度的RTP培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT檢測HepG2細胞增殖，篩選出RTP對HepG2細胞的最佳作用質量濃度和時間進行后續(xù)實驗.

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖

細胞培養(yǎng)結束后，每孔加入20 μL的MTT溶液(質量分數為5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h.棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，充分振蕩，待結晶紫溶解完全后，混合均勻，于酶標儀490 nm處測定光密度吸光度值D(490nm).實驗重復3次.

1.2.4 HepG2細胞轉染

對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板中，當細胞生長匯合度達60%時，更換不含FBS的培養(yǎng)基，參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書，分別將anti-miR-151、anti-miR-NC、miR-151 mimics及miR-NC轉染至HepG2細胞，轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基.qRT-PCR檢測細胞中miR-151表達水平驗證轉染效果.繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞，用于后續(xù)實驗.

1.2.5 HepG2細胞分組

未轉染的HepG2細胞分為Con組和RTP組，Con組用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，RTP組用含最佳質量濃度RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng).轉染anti-miR-151、anti-miR-NC的細胞用不含RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別記為anti-miR-151組和anti-miR-NC組.轉染miR-151 mimics、miR-NC的細胞用含最佳質量濃度RTP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別記為RTP+miR-151組和RTP+miR-NC組.

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

未轉染及轉染后的HepG2細胞，調整密度為2.5×105/mL，接種于24孔板中.細胞貼壁后，按照1.2.5分組處理，每組設置3個復孔.培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞.取1×106個細胞，PBS清洗后，加入100 μL結合緩沖液重懸細胞.加入10 μL的Annexin V-FITC，室溫避光反應10 min.再加入5 μL的碘化丙啶，室溫避光反應10 min.加入400 μL結合緩沖液混勻，流式細胞儀檢測細胞凋亡.

1.2.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

細胞遷移實驗：未轉染及轉染后的HepG2細胞用不含FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞密度為2.5×105/mL.取100 μL細胞懸液加入Transwell上室，下室加入500 μL含體積分數10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基.按照1.2.5分組處理，每組設置3個復孔.培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，吸棄培養(yǎng)液.經多聚甲醛固定、結晶紫染色后，棉簽擦去未遷移細胞，PBS清洗.顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，計數.

細胞侵襲實驗：實驗前，先在上室鋪設Matrigel基質膠(Matrigel與RPMI 1640培養(yǎng)基以體積比為1∶8的比例稀釋)，自然晾干.然后在加入100 μL細胞懸液，剩余操作與細胞遷移實驗相同.

1.2.8 qRT-PCR法檢測細胞中mRNA的表達水平

各組細胞培養(yǎng)48 h后，Trizol試劑提取細胞中總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度.選取D(260nm)/D(280nm)處于1.8～2.0范圍內溶液，逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA.然后以cDNA為模板，進行PCR擴增.擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，共進行35個循環(huán).引物序列見表1.miR-151以U6為內參，P21、CyclinD1、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2均以GAPDH為內參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-151及P21，CyclinD1，Bcl-2，Bax,E-cadherin和MMP-2的mRNA的相對表達水平.

表1 引物序列

1.2.9 Western Blot法檢測蛋白表達水平

各組細胞培養(yǎng)48 h后，細胞裂解液提取細胞中總蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心后收集上清液，BCA蛋白試劑盒測定蛋白質量濃度.取適量蛋白溶液，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min.蛋白變性后，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳.電泳后，轉至PVDF膜，將其置于質量濃度為5%的脫脂奶粉溶液中封閉1 h.TBST洗膜后，分別加入一抗P21(VP21∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、Cyclin D1(VCyclin D1∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、Bcl-2(VBcl-2∶V抗體稀釋液=1∶800)、Bax(VBax∶V抗體稀釋液=1∶800)、E-cadherin(VE-cadherin∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、MMP-2(VMMP-2∶V抗體稀釋液=1∶1 000)和GAPDH(VGAPDH∶V抗體稀釋液=1∶2 000)，4 ℃孵育過夜.次日，TBST洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶5 000)，室溫孵育1 h.TBST洗膜后，加入ECL顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照.以GAPDH為內參，Image J軟件分析目的蛋白相對表達水平.目的蛋白相對表達水平以其條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 RTP作用的質量濃度和時間的篩選

與Con組肝細胞L-02比，低質量濃度(0.65、1.25、2.5 mg/mL)的RTP對抑制肝細胞L-02細胞活性無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而高質量濃度(5、7.5、10 mg/mL)的RTP可抑制肝細胞L-02活性(P<0.05)，因此選擇0.65、1.25、2.5 mg/mL的RTP作為對HepG2細胞作用的最佳質量濃度.與Con組比，RTP組HepG2細胞培養(yǎng)48 h和72 h后的活性、培養(yǎng)48 h后細胞中增殖相關因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，腫瘤抑制因子P21的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，表明RTP可抑制HepG2細胞增殖(圖1).質量濃度為1.25 mg/mL的RTP作用于HepG2細胞48 h時，HepG2細胞存活率接近50%，因此后續(xù)實驗選擇RTP的作用質量濃度為1.25 mg/mL，作用時間為48 h.

A: RTP對肝細胞L-02活性的影響；B：RTP對HepG2細胞的細胞活性的影響；C：RTP對HepG2細胞Cyclin D1和P21 mRNA表達的影響；D：RTP對HepG2細胞Cyclin D1和P21蛋白的表達的影響.1)與Con組比較，P<0.05；2)與RTP 0.65 mg/mL組比較，P<0.05；3)與RTP 1.25 mg/mL組比較，P<0.05.

2.2 RTP對HepG2細胞凋亡、遷移和侵襲的影響

與Con組比，RTP組HepG2細胞凋亡率、促凋亡因子Bax和遷移侵襲相關因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數、抗凋亡因子Bcl-2和遷移侵襲相關因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，表明RTP可抑制HepG2細胞遷移和侵襲，并促進其凋亡(圖2).

A：RTP對HepG2細胞凋亡的影響；B：RTP對HepG2細胞遷移、侵襲的影響，×200; C：RTP對HepG2細胞Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的mRNA表達的影響; D：RTP對HepG2細胞Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2蛋白表達的影響.1)與Con組比較，P<0.05.

2.3 RTP對HepG2細胞中miR-151表達的影響

與Con組比，RTP組HepG2細胞中miR-151表達水平顯著降低(P<0.05)，表明RTP可降低HepG2細胞中miR-151表達(表2).

表2 RTP對HepG2細胞中miR-151表達的影響

2.4 抑制miR-151對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

anti-miR-151組miR-151水平顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明miR-151抑制劑轉染成功，HepG2細胞中miR-151表達被抑制(表3).與anti-miR-NC組比，anti-miR-151組HepG2細胞活性、遷移和侵襲細胞數及增殖相關因子Cyclin D1、抗凋亡因子Bcl-2和遷移侵襲相關因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，HepG2細胞凋亡率及腫瘤抑制因子P21、促凋亡因子Bax和遷移侵襲相關因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，表明抑制miR-151可抑制HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡(圖3).

A：抑制miR-151對HepG2細胞增殖的影響；B：抑制miR-151對HepG2細胞凋亡的影響；C：抑制miR-151對HepG2細胞遷移和侵襲的影響，×200；D：抑制miR-151對Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的mRNA表達的影響；E：抑制miR-151對Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的蛋白表達的影響.1)與anti-miR-NC組比較，P<0.05.

表3 抑制HepG2細胞miR-151表達的驗證情況

2.5 過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞增殖的影響

與RTP+miR-NC組比，RTP+miR-151組HepG2細胞活性和增殖相關因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)，腫瘤抑制因子P21的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)，表明過表達miR-151逆轉了RTP對HepG2細胞的增殖的抑制作用(圖4、表4).

A：過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞增殖的影響；B：過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞Cyclin D1和P21的mRNA表達的影響; C：過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞Cyclin D1和P21的蛋白表達的影響.1)與Con組比較，P<0.05；2)與RTP+miR-NC組比較，P<0.05.

表4 過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞miR-151表達的影響

2.6 過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞凋亡、遷移和侵襲的影響

與RTP+miR-NC組比，RTP+miR-151組遷移和侵襲細胞數及抗凋亡因子Bcl-2和遷移侵襲相關因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，HepG2細胞凋亡率及促凋亡因子Bax和遷移侵襲相關因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，表明過表達miR-151逆轉了RTP對HepG2細胞遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用(圖5).

A：過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞遷移和侵襲的影響,×200；B：過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞凋亡的影響；C:過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞中E-cadherin和MMP-2的mRNA表達的影響;D：過表達miR-151對RTP作用的HepG2細胞中E-cadherin和MMP-2的蛋白表達的影響.

3 討論

細胞增殖紊亂可誘發(fā)腫瘤[8].Cyclin D1是參與細胞周期調控和維持細胞正常增殖的關鍵蛋白，其表達升高可促進腫瘤細胞的增殖[9].P21基因是目前已被證實的腫瘤抑制因子，其表達升高可抑制腫瘤細胞增殖[10].本研究結果顯示，三葉青根多糖可能通過上調P21蛋白表達和下調Cyclin D1蛋白表達抑制HepG2細胞的增殖.細胞凋亡是一種細胞自主生理性死亡，對機體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定具有極其重要的作用，細胞凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的一種手段[11].促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2家族中重要成員.Bax表達的升高或Bcl-2表達的降低可誘導細胞凋亡[12].本研究結果顯示，三葉青根多糖作用后，HepG2細胞凋亡率和Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，提示三葉青根多糖可能通過上調Bax蛋白表達和下調Bcl-2蛋白表達誘導HepG2細胞凋亡.腫瘤復發(fā)和轉移是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因.基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類可降解基底膜和細胞外基質的酶類，參與調控腫瘤細胞的遷移和侵襲[13].上皮-間質轉化是腫瘤細胞侵襲和轉移的重要過程，上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)是上皮-間質轉化過程的主要標志性蛋白，其所介導的上皮細胞間的黏附可有效地抑制腫瘤的細胞遷移和侵襲[14].本研究結果顯示，三葉青根多糖可能通過上調E-cadherin蛋白表達和下調MMP-2蛋白表達抑制HepG2細胞的遷移和侵襲能力.

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為18～25個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，參與調控細胞增殖、凋亡、分化等生物學過程[15-16]，可作為抑癌或癌因子在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[17].研究顯示，miR-151在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)組織中表達水平明顯高于癌旁組織，其高表達與PTC患者病灶數量、局部侵犯、淋巴結轉移和病理分期等臨床病理特征密切相關[18]；miR-151高表達的前列腺癌患者存活率較低[19]；肝癌組織中miR-151表達上調，促進肝癌侵襲轉移[20].本研究結果顯示，抑制miR-151表達可抑制肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進HepG2細胞凋亡，這與Ding等[21]報道的肝細胞癌中miR-151表達增加，miR-151過表達可促進肝癌細胞的侵襲和轉移結果一致，提示miR-151作為促癌基因參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展，是肝癌治療的潛在分子靶點.研究顯示，黃芪-莪術可通過下調miR-151表達誘導HepG2細胞凋亡[22].白藜蘆醇可通過下調miR-151表達抑制HepG2細胞增殖，并誘導其凋亡[23].為了探討三葉青根多糖發(fā)揮抗肝癌作用的分子機制，本研究采用qRT-PCR檢測了三葉青根多糖對HepG2細胞中miR-151表達的影響，結果顯示三葉青根多糖可抑制HepG2細胞中miR-151的表達.此外，過表達miR-151表達逆轉了三葉青根多糖對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，提示三葉青根多糖可能通過下調miR-151表達影響HepG2細胞的生物學行為.

綜上所述，三葉青根多糖可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡，可能與下調細胞中miR-151表達有關.本實驗也存在一定的不足之處，接下來將進一步通過體內實驗探討三葉青根多糖對肝癌腫瘤生長的影響，為肝癌治療藥物的研發(fā)提供新方向.