何珊， 王穎芳， 杜紅衛(wèi)， 周勇偉， 李曉飛*， 薛靜*

(1.浙江大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，浙江 杭州 310000；2.浙江大學(xué) 附屬金華醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，浙江 金華 321000；3.浙江大學(xué) 附屬金華醫(yī)院 骨一科，浙江 金華 321000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及多處關(guān)節(jié)的免疫性疾病，涉及免疫系統(tǒng)的平衡、滑膜細(xì)胞的增殖和炎性因子的釋放等多個(gè)方面[1-2].滑膜細(xì)胞的不斷增殖與炎性因子的釋放會(huì)不斷侵襲軟骨組織及軟骨下骨組織，在生物力學(xué)作用下，造成關(guān)節(jié)畸形，甚至是關(guān)節(jié)功能的喪失.目前針對(duì)RA的治療主要局限于藥物和手術(shù)治療，但效果不佳[3-4].因此尋找一種安全有效的治療方法十分必要.機(jī)械牽張力學(xué)信號(hào)在骨科相關(guān)疾病的作用已經(jīng)越來(lái)越引起人們的關(guān)注，其中新型機(jī)械通道蛋白Piezo1是最近發(fā)現(xiàn)的，與生物力學(xué)信號(hào)密切相關(guān)的跨膜蛋白分子[5-6].有研究證明，Piezo1蛋白參與骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)軟骨細(xì)胞的凋亡以及成骨細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[7-8]，但是在RA滑膜細(xì)胞中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，本研究以新型機(jī)械激活性離子通道Piezo1為研究對(duì)象，探究在人RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA fibroblast-like synoviocyte, RAFLS)中的細(xì)胞增殖和炎性介質(zhì)釋放過(guò)程中的作用，利用EKR1/2的抑制劑PD98059進(jìn)行干預(yù)[9-10]，探討MAPK/ERK1/2信號(hào)通路作為Piezo1下游信號(hào)通路的可能，并研究相關(guān)作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組織

以自2017年1月至2018年3月收入浙江大學(xué)金華醫(yī)院(金華市中心醫(yī)院)的RA患者和車(chē)禍截肢患者為研究對(duì)象.RA患者行關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)或者人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)獲取滑膜組織，抽取膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液.正常對(duì)照者滑膜組織和關(guān)節(jié)液取自車(chē)禍外傷致下肢截肢患者.所有患者均獲知情同意，簽署知情同意書(shū).本方案獲得了浙江大學(xué)金華醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理編號(hào)為：2017-ZHZXYY-098.

1.1.2 試劑與儀器

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基等均購(gòu)自北京碧云天生物有限公司；CCK-8試劑盒，白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司.熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)Flexcell 4000T由浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)室共享.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)滑膜組織的Piezo1蛋白表達(dá)

滑膜組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定后，-80 ℃超低溫冰箱保存，冰凍切片機(jī)切片，厚度為20 μm，PBST溶液清洗3次，每次5 min，體積分?jǐn)?shù)為1%的HCl孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫孵育20 min，PBST溶液清洗后4 ℃避光過(guò)夜孵育Piezo1蛋白一抗(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶100)孵育時(shí)間>12 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min，生物素標(biāo)記的二抗(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶500)孵育30 min，避光.PBST溶液清洗后HRP-親和素孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，DAB染色10 min后光學(xué)顯微鏡下觀察.各取 5 個(gè)視野，應(yīng)用 Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的積分吸光度值和陽(yáng)性面積值，分析Piezo1蛋白的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.2 RAFLS的分離與培養(yǎng)

采用組織塊法對(duì)RA滑膜組織進(jìn)行培養(yǎng)，利用眼科剪對(duì)關(guān)節(jié)鏡下獲得的滑膜組織塊修剪成1 mm3的組織，利用體積分?jǐn)?shù)為5%的膠原酶處理4 h，體積分?jǐn)?shù)為2.5%的胰蛋白酶處理30 min，經(jīng)細(xì)胞篩分離后，加入混有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置入37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d換液一次，細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代.取P3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3 流式細(xì)胞儀鑒定RAFLS

P3代RAFLS細(xì)胞融合率為90%時(shí)，利用胰蛋白酶將其消化，添加培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，5×106個(gè)細(xì)胞分別移至3個(gè)流式管，常溫離心機(jī)2 000 r/min離心5 min，去掉上清液，PBS清洗3次，常溫離心機(jī)2 000 r/min離心5 min，再次去掉上清液，其中2個(gè)流式管分別加入兔抗人CD90、CD68(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶200)，剩余1管不加任何抗體，作為陰性對(duì)照.避光條件下4 ℃下孵育20～30 min，用 PBS 液清洗兩次，2 000 r/min 離心 5 min，棄上清液，0.5 mL PBS 重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè) RAFLS 細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD90、CD68 的表達(dá)情況，以表面標(biāo)記物陽(yáng)性百分比(%)來(lái)表示.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)RAFLS的波形蛋白表達(dá)

將已消毒的20 mm蓋玻片置于90 mm培養(yǎng)皿中，將P3代RAFLS細(xì)胞調(diào)整為2×104/mL的細(xì)胞懸液，接種1 mL于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片.PBS清洗3次，1 min/次，冰丙酮固定15 min.空氣干燥 5 min，PBS清洗3次，2 min/次.體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Triton X-100孵育20 min，PBS清洗3次，2 min/次.體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫孵育 15 min.封閉血清孵育20 min.波形蛋白一抗孵育(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶200)，4 ℃濕盒中過(guò)夜，PBS清洗3次，5 min/次.HRP二抗工作液避光孵育30 min.PBS清洗3次，5 min/次.DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色)約3～10 min，蒸餾水洗2次，1 min/次，樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察.

1.2.5 siRNA-Piezo1干擾載體的構(gòu)建和慢病毒轉(zhuǎn)染

siRNA-Piezo1基因干擾載體的構(gòu)建和篩選由上海吉?jiǎng)P公司完成.首先通過(guò)Pubmed Genebank 查詢?nèi)嗽碢iezo1蛋白的基因序列以及ORF序列和3′-UTR序列.根據(jù)siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，構(gòu)建siRNA-Piezo1的干擾序列.選取上海吉?jiǎng)P公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對(duì)象，加入siRNA-Piezo1干擾序列后，轉(zhuǎn)染RAFLS細(xì)胞，進(jìn)行克隆測(cè)定，然后抽提質(zhì)粒，包裝慢病毒以備用.

慢病毒轉(zhuǎn)染前24 h，將靶細(xì)胞接種到96孔板中，使每孔中細(xì)胞數(shù)量在(3～5)×103之間，然后每孔添加100 μL培養(yǎng)基，各種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度是不一致的，為了得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在細(xì)胞融合率為40%～60%時(shí)予以病毒感染，因?yàn)槁《揪哂休^長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間，所以在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞應(yīng)該呈現(xiàn)出較為稀疏的狀態(tài).利用RT-PCR檢測(cè)Piezo1mRNA的表達(dá)量，以驗(yàn)證干擾效果.

1.2.6 體外細(xì)胞牽張應(yīng)力模型的建立

取P3代RAFLS細(xì)胞，均勻接種于FlexCell公司的膜性6孔板中，待細(xì)胞融合率>60%時(shí)，加載機(jī)械牽張應(yīng)力.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置周期為6次/s，幅度為20%，強(qiáng)度為50 Hz.時(shí)間梯度為24和48 h.

1.2.7 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分成空白對(duì)照組(不加載牽張應(yīng)力，不添加干預(yù)試劑)；siRNA-Piezo1組(細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1)；siRNA-Piezo1+PD98059組(細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1后，添加ERK1/2的抑制劑PD98059進(jìn)行干預(yù))；24 h應(yīng)力組(加載24 h 牽張應(yīng)力，不添加干預(yù)試劑)，siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組(細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1后，加載牽張應(yīng)力干預(yù)24 h)；siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應(yīng)力組(細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1后，添加ERK1/2的抑制劑PD98059進(jìn)行干預(yù)，加載牽張應(yīng)力干預(yù)24 h)；48 h應(yīng)力組(加載48 h 牽張應(yīng)力，不添加干預(yù)試劑)；siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組(細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1后，加載牽張應(yīng)力干預(yù)48 h)；siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應(yīng)力組(細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1后，添加ERK1/2的抑制劑PD98059進(jìn)行干預(yù)，加載牽張應(yīng)力干預(yù)48 h).

1.2.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集各組細(xì)胞制成密度為1.1×106/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，100 μL/孔，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，然后每孔加入100 μL CCK-8試劑，避光37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(450 nm).細(xì)胞增殖率=[D(450 nm)干預(yù)-D(450 nm)空白]/[D(450 nm)對(duì)照-D(450 nm)空白]×100%.

1.2.9 ELISA試劑盒檢測(cè)關(guān)節(jié)液和細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平

根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，以膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液和滑膜細(xì)胞的上清液為研究對(duì)象，采用酶標(biāo)儀吸光度法進(jìn)行檢測(cè).將樣本放置于ELISA試劑盒自帶去酶96孔板，按照質(zhì)量濃度梯度加入IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑，酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度D(450 nm).在Excel中對(duì)D(450 nm)數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸分析，利用競(jìng)爭(zhēng)法反曲線進(jìn)行處理.以1/D(450 nm)為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為Y軸，作標(biāo)準(zhǔn)曲線.得到方程y=2.640 9x2+6.129 7x-9.802 1.再將測(cè)得各個(gè)樣品孔的D(450 nm)值代入公式計(jì)算出目的因子的質(zhì)量濃度.

1.2.10 RT-PCR法檢測(cè)Piezo1和ERK1/2的mRNA相對(duì)表達(dá)

利用胰蛋白酶收集各組細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液清洗3次，常溫離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol 溶劑，提取細(xì)胞總RNA，保證RNA純度為1.8～2.1，然后利用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，采用20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存，采用TAKARA熒光定量PCR試劑盒的要求，采用FTC-2000 RT-PCR系統(tǒng)和20 μL反應(yīng)體系對(duì)樣本DNA進(jìn)行分析，具體反應(yīng)體系如下：加入4 μL cDNA(10倍稀釋)，0.4 μL 正向引物，0.4 μL 反向引物，10 μL SYBR Green Master Mix，0.2 μL 50×ROX Reference Dye 2和5 μL ddH2O，從而組成20 μL反應(yīng)體系.溶解曲線確定Tm值為53.7 ℃，統(tǒng)計(jì)并記錄各組樣本的CT值，采用2-ΔΔCT法對(duì)Piezo1和ERK1/2mRNA的相對(duì)表達(dá)水平.具體引物序列見(jiàn)表1.

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RA患者和正常對(duì)照者滑膜組織的Piezo1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組化的結(jié)果顯示，RA患者滑膜組織中Piezo1蛋白的表達(dá)量要明顯高于正常對(duì)照者，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖1).

A: RA患者滑膜組織中Piezo1蛋白的表達(dá)；B: 正常對(duì)照者滑膜組織中Piezo1蛋白的表達(dá)；C: RA患者和正常對(duì)照組中Piezo 1表達(dá)量的比較結(jié)果.1)與正常對(duì)照者相比較，P<0.05.

2.2 RA患者和正常對(duì)照者關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)結(jié)果

ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，RA患者膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量要明顯高于正常對(duì)照者，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖2).

1)P<0.05.

2.3 RAFLS細(xì)胞的鑒定結(jié)果

顯微鏡下，提取原代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形和多角形(圖3A)；免疫組化染色顯示P3代細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性(圖3B)；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，P3代細(xì)胞CD68陽(yáng)性率為0.51%，CD90陽(yáng)性率為94.38%(圖3C、D).波形蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，并且細(xì)胞表面CD90蛋白表達(dá)量高，CD68蛋白表達(dá)量低，符合RAFLS細(xì)胞特征，可以用作下一步實(shí)驗(yàn).

A：原代滑膜細(xì)胞(×200)；B：波形蛋白免疫組化染色(×200)；C：P3代細(xì)胞CD68陽(yáng)性率；D.P3代細(xì)胞 CD68陽(yáng)性率.

2.4 siRNA-Piezo1干擾序列轉(zhuǎn)染RAFLS細(xì)胞的結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察，慢病毒轉(zhuǎn)染RAFLS細(xì)胞的效率大于90%，RT-PCR結(jié)果顯示，siRNA-Piezo1干擾序列轉(zhuǎn)染RAFLS細(xì)胞后，Piezo1mRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.05，圖4).

1)P<0.05.

2.5 牽張應(yīng)力模型下RAFLS細(xì)胞的狀態(tài)

光學(xué)顯微鏡下結(jié)果顯示，機(jī)械牽張應(yīng)力加載24 h后，RAFLS細(xì)胞分布較為密集，而機(jī)械牽張應(yīng)力加載 48 h后，細(xì)胞密集程度更高，數(shù)量更多(圖5 A、D和G)；另外，siRNA-Piezo1和PD98059干預(yù)后，RAFLS細(xì)胞數(shù)較為稀疏(圖5 B-I).

A：空白對(duì)照組；B：siRNA-Piezo1組；C：siRNA-Piezo1+PD98059組；D：24 h應(yīng)力組；E：siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組；F：siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應(yīng)力組；G：48 h應(yīng)力組；H：siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組；I：siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應(yīng)力組.

2.6 siRNA-Piezo1和PD98059干預(yù)對(duì)RAFLS細(xì)胞增殖的影響

CCK-8測(cè)定結(jié)果顯示，24 h應(yīng)力組和48 h應(yīng)力組RAFLS細(xì)胞的增殖率均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組RAFLS細(xì)胞的增殖率分別明顯低于24 h應(yīng)力組和48 h應(yīng)力組(P<0.05)，siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應(yīng)力組RAFLS細(xì)胞的增殖率分別明顯低于24 h應(yīng)力組和48 h應(yīng)力組(P<0.05)及siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組(P<0.05)(圖6).

A: 不同牽張應(yīng)力對(duì)RAFLS細(xì)胞增殖的影響；B：不同干擾抑制作用對(duì)RAFLS細(xì)胞增殖的影響；C：不同干擾抑制作用對(duì)24 h牽張應(yīng)力下RAFLS細(xì)胞增殖的影響；D：不同干擾抑制作用對(duì)48 h牽張應(yīng)力下RAFLS細(xì)胞增殖的影響.1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05；2)：與24 h牽張應(yīng)力組比較，P<0.05；3)與siRNA-Piezo1組比較，P<0.05；4)與牽張應(yīng)力組比較，P<0.05；5)與siRNA-Piezo1+牽張應(yīng)力組比較，P<0.05.

2.7 siRNA-Piezo1和PD98059干預(yù)對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，24 h應(yīng)力組和48 h應(yīng)力組細(xì)胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量要明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05).siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組細(xì)胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量要明顯低于24 h應(yīng)力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應(yīng)力組細(xì)胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量要明顯低于siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組細(xì)胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量要明顯低于48 h應(yīng)力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應(yīng)力組細(xì)胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量要明顯低于siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組(P<0.05)(圖7).

A：各組細(xì)胞上清液的IL-1β的表達(dá)；B：各組細(xì)胞上清液的IL-6的表達(dá)；C：各組細(xì)胞上清液的TNF-α的表達(dá).

2.8 siRNA-Piezo1和PD98059干預(yù)對(duì)Piezo1和ERK1/2相對(duì)表達(dá)量的影響

RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，24 h應(yīng)力組和48 h應(yīng)力組細(xì)胞Piezo1和ERK1/2的mRNA的相對(duì)表達(dá)量要明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05).siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組細(xì)胞Piezo1和ERK1/2的mRNA的相對(duì)表達(dá)量要明顯低于24 h應(yīng)力組和48 h應(yīng)力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應(yīng)力組細(xì)胞Piezo1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量與siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組無(wú)明顯差異(P>0.05)，但是siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應(yīng)力組細(xì)胞ERK1/2的mRNA的相對(duì)表達(dá)量要明顯低于siRNA-Piezo1+24 h應(yīng)力組和siRNA-Piezo1+48 h應(yīng)力組(P<0.05)(圖8).

A:各組RAFLS細(xì)胞的Piezo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；B:各組RAFLS細(xì)胞的ERK1/2 mRNA相對(duì)表達(dá)量.

3 討論

RA是臨床上的常見(jiàn)病和多發(fā)病，主要與機(jī)體的免疫反應(yīng)和關(guān)節(jié)腔滑膜組織炎癥反應(yīng)密切相關(guān).RA的病理特點(diǎn)包括滑膜細(xì)胞的增生和炎癥細(xì)胞的集聚、炎性因子的分泌[11-12].本研究主要聚焦于RA患者膝關(guān)節(jié)腔滑膜細(xì)胞的增殖特點(diǎn)和炎性因子的釋放，并且以新型機(jī)械應(yīng)力激活蛋白通道Piezo1為研究的切入點(diǎn)，探究其介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)在滑膜細(xì)胞增殖和炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)釋放的表達(dá)特點(diǎn)，并且以ERK1/2信號(hào)通路為切入點(diǎn)進(jìn)一步研究其機(jī)制，以期為RA的治療和預(yù)防提供新的思路和方法.

既往研究表明，Piezo1蛋白的表達(dá)與OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，在牽張應(yīng)力作用下，OA軟骨細(xì)胞中Piezo1蛋白的表達(dá)量明顯增加，而且可以通過(guò)ERK5信號(hào)通路介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡，進(jìn)而促進(jìn)OA的進(jìn)展[13].也有研究表明，Piezo1蛋白的激活可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和增殖，利用Piezo1蛋白抑制劑GsMTx4抑制Piezo1蛋白的表達(dá)后，可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的侵襲[14].與之前的研究結(jié)果相同，本研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)械牽張應(yīng)力作用下，滑膜細(xì)胞中Piezo1mRNA表達(dá)水平明顯增加，而且隨著加載時(shí)間的延長(zhǎng)，Piezo1的mRNA表達(dá)水平也相應(yīng)提高.而且CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著牽張應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，滑膜細(xì)胞的增殖率明顯增加.這些結(jié)果說(shuō)明，Piezo1蛋白的表達(dá)量與滑膜細(xì)胞的增殖密切相關(guān).另外，本研究還通過(guò)siRNA技術(shù)抑制了Piezo1的表達(dá)，結(jié)果表明，siRNA-Piezo1可以抑制滑膜細(xì)胞的增殖，因此，Piezo1可以介導(dǎo)力學(xué)信號(hào)刺激下滑膜細(xì)胞的增殖，對(duì)其具有促進(jìn)作用.并且siRNA-Piezo1可以通過(guò)抑制Piezo1的表達(dá)，而達(dá)到抑制滑膜細(xì)胞增殖的效果.

RA患者關(guān)節(jié)病變除了與滑膜細(xì)胞增殖有關(guān)，還與炎性因子的過(guò)度表達(dá)密不可分.Jahid等[15]的結(jié)果表明，RA患者血清中IL-1β的表達(dá)明顯增高.本研究利用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，結(jié)果表明，牽張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，而利用siRNA抑制Piezo1的表達(dá)，聯(lián)合PD98059小分子物質(zhì)抑制ERK1/2的表達(dá)，可以抑制上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，并且效果要優(yōu)于單純一種方案.可見(jiàn)牽張應(yīng)力可以促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞炎性因子表達(dá)量的增加，并且可以被siRNA-Piezo1和PD98059小分子物質(zhì)所抑制.

另外，本研究還通過(guò)構(gòu)建體外滑膜細(xì)胞牽張應(yīng)力細(xì)胞模型，對(duì)Piezo1介導(dǎo)滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)炎性因子釋放的機(jī)制進(jìn)行了更深層次的探索.既往研究中，ERK1/2蛋白是一種以脯氨酸為導(dǎo)向的外源性絲氨酸/蘇氨酸激酶，促進(jìn)MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白絲氨酸、蘇氨酸雙位點(diǎn)的磷酸化水平，從而使得生物學(xué)信號(hào)向下傳導(dǎo).有研究表明，ERK1/2與血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等細(xì)胞增殖密切相關(guān)，可以調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[16-17].在此基礎(chǔ)上，本研究以ERK 1/2為切入點(diǎn)，對(duì)Piezo1蛋白介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行探索.RT-PCR結(jié)果表明，siRNA抑制Piezo1的表達(dá)可以抑制EKR1/2的表達(dá)，但是反過(guò)來(lái)，通過(guò)PD98059小分子物質(zhì)抑制ERK1/2的表達(dá)不能抑制Piezo1的表達(dá)，這些結(jié)果說(shuō)明ERK1/2蛋白可能是Piezo1蛋白的下游信號(hào)分子，可以傳遞力學(xué)信號(hào).

綜上所述，力學(xué)信號(hào)可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖和炎性因子的釋放，并且siRNA-Piezo1可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路阻斷力學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)而發(fā)揮抑制滑膜細(xì)胞增殖和炎性因子的釋放的作用.