何珊， 王穎芳， 杜紅衛(wèi)， 周勇偉， 李曉飛*， 薛靜*

(1.浙江大學 附屬第二醫(yī)院 風濕免疫科，浙江 杭州 310000；2.浙江大學 附屬金華醫(yī)院 風濕免疫科，浙江 金華 321000；3.浙江大學 附屬金華醫(yī)院 骨一科，浙江 金華 321000)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及多處關節(jié)的免疫性疾病，涉及免疫系統(tǒng)的平衡、滑膜細胞的增殖和炎性因子的釋放等多個方面[1-2].滑膜細胞的不斷增殖與炎性因子的釋放會不斷侵襲軟骨組織及軟骨下骨組織，在生物力學作用下，造成關節(jié)畸形，甚至是關節(jié)功能的喪失.目前針對RA的治療主要局限于藥物和手術治療，但效果不佳[3-4].因此尋找一種安全有效的治療方法十分必要.機械牽張力學信號在骨科相關疾病的作用已經(jīng)越來越引起人們的關注，其中新型機械通道蛋白Piezo1是最近發(fā)現(xiàn)的，與生物力學信號密切相關的跨膜蛋白分子[5-6].有研究證明，Piezo1蛋白參與骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)軟骨細胞的凋亡以及成骨細胞的增殖和分化過程[7-8]，但是在RA滑膜細胞中的作用尚未見報道.因此，本研究以新型機械激活性離子通道Piezo1為研究對象，探究在人RA成纖維樣滑膜細胞(RA fibroblast-like synoviocyte, RAFLS)中的細胞增殖和炎性介質釋放過程中的作用，利用EKR1/2的抑制劑PD98059進行干預[9-10]，探討MAPK/ERK1/2信號通路作為Piezo1下游信號通路的可能，并研究相關作用機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗組織

以自2017年1月至2018年3月收入浙江大學金華醫(yī)院(金華市中心醫(yī)院)的RA患者和車禍截肢患者為研究對象.RA患者行關節(jié)鏡清理術或者人工全膝關節(jié)置換術時獲取滑膜組織，抽取膝關節(jié)關節(jié)液.正常對照者滑膜組織和關節(jié)液取自車禍外傷致下肢截肢患者.所有患者均獲知情同意，簽署知情同意書.本方案獲得了浙江大學金華醫(yī)院倫理委員會的批準，倫理編號為：2017-ZHZXYY-098.

1.1.2 試劑與儀器

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基等均購自北京碧云天生物有限公司；CCK-8試劑盒，白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的ELISA試劑盒均購自武漢默沙克生物科技有限公司.熒光定量PCR試劑盒購自日本TAKARA公司；細胞牽張應力加載系統(tǒng)Flexcell 4000T由浙江大學基礎醫(yī)學院生物力學實驗室共享.

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學染色檢測滑膜組織的Piezo1蛋白表達

滑膜組織經(jīng)體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定后，-80 ℃超低溫冰箱保存，冰凍切片機切片，厚度為20 μm，PBST溶液清洗3次，每次5 min，體積分數(shù)為1%的HCl孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，體積分數(shù)為3%的過氧化氫孵育20 min，PBST溶液清洗后4 ℃避光過夜孵育Piezo1蛋白一抗(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶100)孵育時間>12 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min，生物素標記的二抗(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶500)孵育30 min，避光.PBST溶液清洗后HRP-親和素孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，DAB染色10 min后光學顯微鏡下觀察.各取 5 個視野，應用 Image-Pro Plus 6.0 軟件測定陽性表達產(chǎn)物的積分吸光度值和陽性面積值，分析Piezo1蛋白的相對表達量.

1.2.2 RAFLS的分離與培養(yǎng)

采用組織塊法對RA滑膜組織進行培養(yǎng)，利用眼科剪對關節(jié)鏡下獲得的滑膜組織塊修剪成1 mm3的組織，利用體積分數(shù)為5%的膠原酶處理4 h，體積分數(shù)為2.5%的胰蛋白酶處理30 min，經(jīng)細胞篩分離后，加入混有體積分數(shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置入37 ℃體積分數(shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，3 d換液一次，細胞融合率達80%以上時，進行細胞傳代.取P3代細胞進行后續(xù)實驗.

1.2.3 流式細胞儀鑒定RAFLS

P3代RAFLS細胞融合率為90%時，利用胰蛋白酶將其消化，添加培養(yǎng)基進行重懸，先進行細胞計數(shù)，5×106個細胞分別移至3個流式管，常溫離心機2 000 r/min離心5 min，去掉上清液，PBS清洗3次，常溫離心機2 000 r/min離心5 min，再次去掉上清液，其中2個流式管分別加入兔抗人CD90、CD68(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶200)，剩余1管不加任何抗體，作為陰性對照.避光條件下4 ℃下孵育20～30 min，用 PBS 液清洗兩次，2 000 r/min 離心 5 min，棄上清液，0.5 mL PBS 重懸，流式細胞儀檢測 RAFLS 細胞表面標記物 CD90、CD68 的表達情況，以表面標記物陽性百分比(%)來表示.實驗重復3次.

1.2.4 免疫組織化學染色檢測RAFLS的波形蛋白表達

將已消毒的20 mm蓋玻片置于90 mm培養(yǎng)皿中，將P3代RAFLS細胞調(diào)整為2×104/mL的細胞懸液，接種1 mL于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片.PBS清洗3次，1 min/次，冰丙酮固定15 min.空氣干燥 5 min，PBS清洗3次，2 min/次.體積分數(shù)為0.5%的Triton X-100孵育20 min，PBS清洗3次，2 min/次.體積分數(shù)為3%的過氧化氫孵育 15 min.封閉血清孵育20 min.波形蛋白一抗孵育(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶200)，4 ℃濕盒中過夜，PBS清洗3次，5 min/次.HRP二抗工作液避光孵育30 min.PBS清洗3次，5 min/次.DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色)約3～10 min，蒸餾水洗2次，1 min/次，樹膠封片，光學顯微鏡下觀察.

1.2.5 siRNA-Piezo1干擾載體的構建和慢病毒轉染

siRNA-Piezo1基因干擾載體的構建和篩選由上海吉凱公司完成.首先通過Pubmed Genebank 查詢?nèi)嗽碢iezo1蛋白的基因序列以及ORF序列和3′-UTR序列.根據(jù)siRNA靶點設計原理，構建siRNA-Piezo1的干擾序列.選取上海吉凱公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對象，加入siRNA-Piezo1干擾序列后，轉染RAFLS細胞，進行克隆測定，然后抽提質粒，包裝慢病毒以備用.

慢病毒轉染前24 h，將靶細胞接種到96孔板中，使每孔中細胞數(shù)量在(3～5)×103之間，然后每孔添加100 μL培養(yǎng)基，各種細胞的生長速度是不一致的，為了得到準確的實驗結果，在細胞融合率為40%～60%時予以病毒感染，因為慢病毒具有較長的表達時間，所以在轉染時細胞應該呈現(xiàn)出較為稀疏的狀態(tài).利用RT-PCR檢測Piezo1mRNA的表達量，以驗證干擾效果.

1.2.6 體外細胞牽張應力模型的建立

取P3代RAFLS細胞，均勻接種于FlexCell公司的膜性6孔板中，待細胞融合率>60%時，加載機械牽張應力.根據(jù)預實驗結果，設置周期為6次/s，幅度為20%，強度為50 Hz.時間梯度為24和48 h.

1.2.7 實驗分組

根據(jù)預實驗結果，將細胞分成空白對照組(不加載牽張應力，不添加干預試劑)；siRNA-Piezo1組(細胞成功轉染siRNA-Piezo1)；siRNA-Piezo1+PD98059組(細胞成功轉染siRNA-Piezo1后，添加ERK1/2的抑制劑PD98059進行干預)；24 h應力組(加載24 h 牽張應力，不添加干預試劑)，siRNA-Piezo1+24 h應力組(細胞成功轉染siRNA-Piezo1后，加載牽張應力干預24 h)；siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應力組(細胞成功轉染siRNA-Piezo1后，添加ERK1/2的抑制劑PD98059進行干預，加載牽張應力干預24 h)；48 h應力組(加載48 h 牽張應力，不添加干預試劑)；siRNA-Piezo1+48 h應力組(細胞成功轉染siRNA-Piezo1后，加載牽張應力干預48 h)；siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應力組(細胞成功轉染siRNA-Piezo1后，添加ERK1/2的抑制劑PD98059進行干預，加載牽張應力干預48 h).

1.2.8 CCK-8檢測細胞增殖

收集各組細胞制成密度為1.1×106/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，100 μL/孔，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，然后每孔加入100 μL CCK-8試劑，避光37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，酶標儀測定吸光度D(450 nm).細胞增殖率=[D(450 nm)干預-D(450 nm)空白]/[D(450 nm)對照-D(450 nm)空白]×100%.

1.2.9 ELISA試劑盒檢測關節(jié)液和細胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平

根據(jù)ELISA試劑盒說明書的要求，以膝關節(jié)的關節(jié)液和滑膜細胞的上清液為研究對象，采用酶標儀吸光度法進行檢測.將樣本放置于ELISA試劑盒自帶去酶96孔板，按照質量濃度梯度加入IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA檢測試劑，酶標儀測定的吸光度D(450 nm).在Excel中對D(450 nm)數(shù)據(jù)進行直線回歸分析，利用競爭法反曲線進行處理.以1/D(450 nm)為X軸，標準品濃度為Y軸，作標準曲線.得到方程y=2.640 9x2+6.129 7x-9.802 1.再將測得各個樣品孔的D(450 nm)值代入公式計算出目的因子的質量濃度.

1.2.10 RT-PCR法檢測Piezo1和ERK1/2的mRNA相對表達

利用胰蛋白酶收集各組細胞，經(jīng)PBS溶液清洗3次，常溫離心機1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol 溶劑，提取細胞總RNA，保證RNA純度為1.8～2.1，然后利用TAKARA逆轉錄試劑盒的要求，采用20 μL反應體系逆轉錄為cDNA，-80 ℃保存，采用TAKARA熒光定量PCR試劑盒的要求，采用FTC-2000 RT-PCR系統(tǒng)和20 μL反應體系對樣本DNA進行分析，具體反應體系如下：加入4 μL cDNA(10倍稀釋)，0.4 μL 正向引物，0.4 μL 反向引物，10 μL SYBR Green Master Mix，0.2 μL 50×ROX Reference Dye 2和5 μL ddH2O，從而組成20 μL反應體系.溶解曲線確定Tm值為53.7 ℃，統(tǒng)計并記錄各組樣本的CT值，采用2-ΔΔCT法對Piezo1和ERK1/2mRNA的相對表達水平.具體引物序列見表1.

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 RA患者和正常對照者滑膜組織的Piezo1免疫組織化學染色結果

免疫組化的結果顯示，RA患者滑膜組織中Piezo1蛋白的表達量要明顯高于正常對照者，比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05，圖1).

A: RA患者滑膜組織中Piezo1蛋白的表達；B: 正常對照者滑膜組織中Piezo1蛋白的表達；C: RA患者和正常對照組中Piezo 1表達量的比較結果.1)與正常對照者相比較，P<0.05.

2.2 RA患者和正常對照者關節(jié)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達結果

ELISA測定結果顯示，RA患者膝關節(jié)關節(jié)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量要明顯高于正常對照者，比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05，圖2).

1)P<0.05.

2.3 RAFLS細胞的鑒定結果

顯微鏡下，提取原代細胞呈長梭形和多角形(圖3A)；免疫組化染色顯示P3代細胞波形蛋白染色陽性(圖3B)；流式細胞儀結果顯示，P3代細胞CD68陽性率為0.51%，CD90陽性率為94.38%(圖3C、D).波形蛋白表達呈陽性，并且細胞表面CD90蛋白表達量高，CD68蛋白表達量低，符合RAFLS細胞特征，可以用作下一步實驗.

A：原代滑膜細胞(×200)；B：波形蛋白免疫組化染色(×200)；C：P3代細胞CD68陽性率；D.P3代細胞 CD68陽性率.

2.4 siRNA-Piezo1干擾序列轉染RAFLS細胞的結果

熒光顯微鏡下觀察，慢病毒轉染RAFLS細胞的效率大于90%，RT-PCR結果顯示，siRNA-Piezo1干擾序列轉染RAFLS細胞后，Piezo1mRNA的表達量明顯降低(P<0.05，圖4).

1)P<0.05.

2.5 牽張應力模型下RAFLS細胞的狀態(tài)

光學顯微鏡下結果顯示，機械牽張應力加載24 h后，RAFLS細胞分布較為密集，而機械牽張應力加載 48 h后，細胞密集程度更高，數(shù)量更多(圖5 A、D和G)；另外，siRNA-Piezo1和PD98059干預后，RAFLS細胞數(shù)較為稀疏(圖5 B-I).

A：空白對照組；B：siRNA-Piezo1組；C：siRNA-Piezo1+PD98059組；D：24 h應力組；E：siRNA-Piezo1+24 h應力組；F：siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應力組；G：48 h應力組；H：siRNA-Piezo1+48 h應力組；I：siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應力組.

2.6 siRNA-Piezo1和PD98059干預對RAFLS細胞增殖的影響

CCK-8測定結果顯示，24 h應力組和48 h應力組RAFLS細胞的增殖率均明顯高于空白對照組(P<0.05)，siRNA-Piezo1+24 h應力組和siRNA-Piezo1+48 h應力組RAFLS細胞的增殖率分別明顯低于24 h應力組和48 h應力組(P<0.05)，siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應力組和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應力組RAFLS細胞的增殖率分別明顯低于24 h應力組和48 h應力組(P<0.05)及siRNA-Piezo1+24 h應力組和siRNA-Piezo1+48 h應力組(P<0.05)(圖6).

A: 不同牽張應力對RAFLS細胞增殖的影響；B：不同干擾抑制作用對RAFLS細胞增殖的影響；C：不同干擾抑制作用對24 h牽張應力下RAFLS細胞增殖的影響；D：不同干擾抑制作用對48 h牽張應力下RAFLS細胞增殖的影響.1)與空白對照組比較，P<0.05；2)：與24 h牽張應力組比較，P<0.05；3)與siRNA-Piezo1組比較，P<0.05；4)與牽張應力組比較，P<0.05；5)與siRNA-Piezo1+牽張應力組比較，P<0.05.

2.7 siRNA-Piezo1和PD98059干預對IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

ELISA測定結果顯示，24 h應力組和48 h應力組細胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量要明顯高于空白對照組(P<0.05).siRNA-Piezo1+24 h應力組細胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量要明顯低于24 h應力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應力組細胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量要明顯低于siRNA-Piezo1+24 h應力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+48 h應力組細胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量要明顯低于48 h應力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應力組細胞上清液的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量要明顯低于siRNA-Piezo1+48 h應力組(P<0.05)(圖7).

A：各組細胞上清液的IL-1β的表達；B：各組細胞上清液的IL-6的表達；C：各組細胞上清液的TNF-α的表達.

2.8 siRNA-Piezo1和PD98059干預對Piezo1和ERK1/2相對表達量的影響

RT-PCR測定結果顯示，24 h應力組和48 h應力組細胞Piezo1和ERK1/2的mRNA的相對表達量要明顯高于空白對照組(P<0.05).siRNA-Piezo1+24 h應力組和siRNA-Piezo1+48 h應力組細胞Piezo1和ERK1/2的mRNA的相對表達量要明顯低于24 h應力組和48 h應力組(P<0.05).siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應力組和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應力組細胞Piezo1的mRNA的相對表達量與siRNA-Piezo1+24 h應力組和siRNA-Piezo1+48 h應力組無明顯差異(P>0.05)，但是siRNA-Piezo1+PD98059+24 h應力組和siRNA-Piezo1+PD98059+48 h應力組細胞ERK1/2的mRNA的相對表達量要明顯低于siRNA-Piezo1+24 h應力組和siRNA-Piezo1+48 h應力組(P<0.05)(圖8).

A:各組RAFLS細胞的Piezo1 mRNA相對表達量；B:各組RAFLS細胞的ERK1/2 mRNA相對表達量.

3 討論

RA是臨床上的常見病和多發(fā)病，主要與機體的免疫反應和關節(jié)腔滑膜組織炎癥反應密切相關.RA的病理特點包括滑膜細胞的增生和炎癥細胞的集聚、炎性因子的分泌[11-12].本研究主要聚焦于RA患者膝關節(jié)腔滑膜細胞的增殖特點和炎性因子的釋放，并且以新型機械應力激活蛋白通道Piezo1為研究的切入點，探究其介導的力學信號在滑膜細胞增殖和炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)釋放的表達特點，并且以ERK1/2信號通路為切入點進一步研究其機制，以期為RA的治療和預防提供新的思路和方法.

既往研究表明，Piezo1蛋白的表達與OA患者膝關節(jié)軟骨細胞的凋亡密切相關，在牽張應力作用下，OA軟骨細胞中Piezo1蛋白的表達量明顯增加，而且可以通過ERK5信號通路介導軟骨細胞的過度凋亡，進而促進OA的進展[13].也有研究表明，Piezo1蛋白的激活可以促進骨肉瘤細胞的侵襲和增殖，利用Piezo1蛋白抑制劑GsMTx4抑制Piezo1蛋白的表達后，可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，抑制細胞的侵襲[14].與之前的研究結果相同，本研究發(fā)現(xiàn)在機械牽張應力作用下，滑膜細胞中Piezo1mRNA表達水平明顯增加，而且隨著加載時間的延長，Piezo1的mRNA表達水平也相應提高.而且CCK-8實驗結果表明，隨著牽張應力加載時間的延長，滑膜細胞的增殖率明顯增加.這些結果說明，Piezo1蛋白的表達量與滑膜細胞的增殖密切相關.另外，本研究還通過siRNA技術抑制了Piezo1的表達，結果表明，siRNA-Piezo1可以抑制滑膜細胞的增殖，因此，Piezo1可以介導力學信號刺激下滑膜細胞的增殖，對其具有促進作用.并且siRNA-Piezo1可以通過抑制Piezo1的表達，而達到抑制滑膜細胞增殖的效果.

RA患者關節(jié)病變除了與滑膜細胞增殖有關，還與炎性因子的過度表達密不可分.Jahid等[15]的結果表明，RA患者血清中IL-1β的表達明顯增高.本研究利用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，結果表明，牽張應力刺激可以促進炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，而利用siRNA抑制Piezo1的表達，聯(lián)合PD98059小分子物質抑制ERK1/2的表達，可以抑制上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，并且效果要優(yōu)于單純一種方案.可見牽張應力可以促進RA滑膜細胞炎性因子表達量的增加，并且可以被siRNA-Piezo1和PD98059小分子物質所抑制.

另外，本研究還通過構建體外滑膜細胞牽張應力細胞模型，對Piezo1介導滑膜細胞增殖、促進炎性因子釋放的機制進行了更深層次的探索.既往研究中，ERK1/2蛋白是一種以脯氨酸為導向的外源性絲氨酸/蘇氨酸激酶，促進MAPK信號通路關鍵蛋白絲氨酸、蘇氨酸雙位點的磷酸化水平，從而使得生物學信號向下傳導.有研究表明，ERK1/2與血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞等細胞增殖密切相關，可以調(diào)控細胞周期，促進細胞的增殖[16-17].在此基礎上，本研究以ERK 1/2為切入點，對Piezo1蛋白介導的力學信號傳導機制進行探索.RT-PCR結果表明，siRNA抑制Piezo1的表達可以抑制EKR1/2的表達，但是反過來，通過PD98059小分子物質抑制ERK1/2的表達不能抑制Piezo1的表達，這些結果說明ERK1/2蛋白可能是Piezo1蛋白的下游信號分子，可以傳遞力學信號.

綜上所述，力學信號可以促進滑膜細胞的增殖和炎性因子的釋放，并且siRNA-Piezo1可能通過ERK1/2信號通路阻斷力學信號的傳導而發(fā)揮抑制滑膜細胞增殖和炎性因子的釋放的作用.