郭永輝，趙連興，柯澤華，張紀(jì)英*，劉貴巧

1(河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲，056000)2(邯鄲市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 邯鄲，056000)

顏色是消費(fèi)者對(duì)食品感官評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一， 隨著時(shí)間的改變，食品在生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸過程中因化學(xué)和物理等原因可改變食品的顏色，為此，化學(xué)類色素的使用成為保持食品良好色澤的主要手段[1]。在市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的化學(xué)類色素大多為偶氮類化合物，與天然色素相比價(jià)格更低，穩(wěn)定性更好[2]。但是偶氮類合成著色劑在人體內(nèi)偶氮還原酶的作用下所釋放的芳香胺具有多重危害，不僅會(huì)造成頭痛以及兒童多動(dòng)癥，甚至可能引發(fā)癌癥[3]。堿性橙、酸性橙、堿性嫩黃O等高毒的工業(yè)染料與人體接觸以及食用后更是具有“三致”等危害[4-5]。

我國監(jiān)督檢測(cè)部門參考的國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2014中明確分類了不同食品所允許添加的人工合成著色劑的最大限量，國家發(fā)布的食品整治辦[2009]29號(hào)文件中將堿性橙、酸性橙、堿性嫩黃O等工業(yè)染料列為禁用食品添加劑[6]。但仍有不法商販非法添加，對(duì)食品安全造成威脅。

在近年對(duì)食品中人工合成著色劑和禁用工業(yè)染料的測(cè)定方法研究中，張?zhí)m天等[7]采用直接稀釋法對(duì)飲料中的人工合成色素進(jìn)行提取，利用高效薄層色譜法進(jìn)行測(cè)定；YI等[8]利用高效毛細(xì)管電泳對(duì)食品中色素進(jìn)行測(cè)定；宋新等[9]利用示波極譜法對(duì)熟肉中的5種水溶性著色劑進(jìn)行測(cè)定。許多學(xué)者利用高效液相色譜法對(duì)不同食品基質(zhì)中的禁用工業(yè)染料和人工合成著色劑進(jìn)行了前處理和測(cè)定方法的優(yōu)化和建立[10-15]。采用固相萃取法，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)不同基質(zhì)中的多種禁用工業(yè)染料進(jìn)行方法優(yōu)化及測(cè)定，可提高檢測(cè)效率[16-19]。目前，市面上同時(shí)應(yīng)用人工合成著色劑和禁用工業(yè)染料的食品主要為液體飲料和腐竹等豆制品，在熟肉制品和醬類中應(yīng)用較少。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.35—2016[20]和GB/T23496—2009[21]則是利用聚酰胺吸附方法和濃縮提取法對(duì)著色劑和工業(yè)染料進(jìn)行提取，其前處理過程復(fù)雜，樣品回收率低，并且國標(biāo)中聚酰胺吸附法不適用于腐竹等豆制品的提取和測(cè)定。國家禁用工業(yè)染料及著色劑的測(cè)定已分別制定了不同的標(biāo)準(zhǔn)，但只針對(duì)一種或幾種色素的提取使用，則較為繁瑣，無法對(duì)樣品同時(shí)提取并兼顧10種色素測(cè)定條件，耗時(shí)耗力。因此，建立一種同時(shí)測(cè)定著色劑和禁用工業(yè)染料的快捷且便利的高效液相色譜法顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀配DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；冷凍高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技中國有限制公司；Agela Venusil XBP-C18色譜柱，博納艾杰爾科技；MIULAB多管渦旋混合儀，杭州米歐儀器有限公司；超純水機(jī)，濟(jì)南太平瑪環(huán)保設(shè)備有限公司；200 g快速開蓋萬能高速粉碎機(jī)，上海比朗儀器有限公司；流動(dòng)相過濾器，津騰；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；0.45 μm PTFE濾膜，津騰。

1.2 化學(xué)試劑

甲醇，正己烷(色譜純)、德國默克；乙酸銨、乙酸鋅(均為分析純),天津市永大化學(xué)試劑有限公司；亞鐵氰化鉀(分析純)，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；超純水；胭脂紅(1 mg/mL)、日落黃(1 mg/mL)、誘惑紅(1 mg/mL)、酸性紅(1 mg/mL)、亮藍(lán)(1 mg/mL)，中國科學(xué)計(jì)量院；堿性橙2(0.25 g)、堿性橙21(0.25 g)、堿性橙22(0.25 g)、酸性橙2(0.25 g)、堿性嫩黃O(0.25 g)，北京曼哈格。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1.2小節(jié)中的固體標(biāo)準(zhǔn)品，用1∶1甲醇水溶解并定容，配制為1 mg/mL單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取適量單標(biāo)溶液，用1∶1甲醇水定容，配制為100 μg/mL的10種混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確移取100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.4 沉淀劑的配制

亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6 g亞鐵氰化鉀，用純水溶解并定容至100 mL[22]。

乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加純水溶解并定容至100 mL[22]。

1.5 色素提取方法

飲料類：準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，含二氧化碳的飲料在50 ℃水浴條件下超聲30 min，驅(qū)除二氧化碳和乙醇，使用80%甲醇水提取色素，定容至25 mL，超聲20 min，放置渦旋儀渦旋2 min，含有固體果粒的飲料需使用離心機(jī)離心。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，上機(jī)。

配制酒類：準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，50 ℃水浴聲條件下超聲30 min驅(qū)除乙醇，用80%甲醇水提取色素，定容至25 mL，超聲20 min，放置渦旋儀渦旋2 min。取混合溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，上機(jī)。

干制豆制品類：取適量干制豆制品至高速粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品，加入1.4小節(jié)中2種沉淀劑各0.5 mL，用80%甲醇水定容至25 mL，超聲20 min,放置旋轉(zhuǎn)振蕩渦旋器70 r/min渦旋約2 min，將低溫冷凍離心機(jī)設(shè)置為9 000 r/min，4℃，離心4 min。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，上機(jī)。

1.6 色譜條件

Agela Venusil XBP-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱；堿性橙2、堿性嫩黃O’波長為449 nm；堿性橙21、堿性橙22、酸性橙2波長為485 nm；胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅波長均為254 nm；亮藍(lán)波長628 nm；流動(dòng)相20 mmol/L醋酸銨溶液-甲醇(梯度洗脫條件見表1)；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min。

表1 5種人工合成著色劑和5種禁用工業(yè)染料的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for 5 synthetic colorants and 5 prohibited industrial dyes

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)根據(jù)1.6小節(jié)中所優(yōu)化的色譜條件對(duì)同等性能的C18色譜柱，分別為SUNTEKTM YWG-C18(250 mm×4.6 mm, 10 μm) 色譜柱、OMNI Hubble-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱、Agela Venusil XBP-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱進(jìn)行比對(duì)。因生產(chǎn)廠家不同、色譜柱固定相填料規(guī)格大小、內(nèi)徑不同、裝填人員不同等產(chǎn)生的偶然性差異對(duì)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性均會(huì)有一定的影響。當(dāng)使用OMNI Hubble-C18色譜柱時(shí)，除酸性橙和堿性橙21以外其他目標(biāo)峰分離良好，但酸性橙2和堿性橙21分離度未達(dá)到1.5，未滿足方法學(xué)試驗(yàn)系統(tǒng)適應(yīng)性要求；當(dāng)使用SUNTEKTM YWG-C18時(shí)，只有5種目標(biāo)物出峰；使用Agela Venusil XBP-C18色譜柱時(shí)，10種目標(biāo)物在25 min內(nèi)完全出峰，分離度均>1.5，無拖尾。故選擇Agele Venusil XBP-C18色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定(3種色譜柱分離度對(duì)比見圖1、圖2和圖3)。

圖1 SUNTEKTM YWG-C18色譜圖Fig.1 SUNTEKTM YWG-C18 column

圖2 OMNI Hubble-C18色譜圖Fig.2 OMNI Hubble-C18 column

圖3 Agela Venusil XBP-C18色譜圖Fig.3 Agela Venusil XBP-C18 column

2.2 柱溫的影響

分別選取20、25、28、30、35 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。柱溫為30 ℃時(shí)，胭脂紅、日落黃、誘惑紅均未出峰；柱溫為28 ℃時(shí)胭脂紅、日落黃、誘惑紅出峰極不穩(wěn)定，由此可見除柱溫箱設(shè)置溫度外，外界環(huán)境溫度也有一定影響；柱溫為20 ℃時(shí)，酸性橙2和堿性橙21出峰重合；柱溫為25 ℃和35 ℃時(shí)出，10種目標(biāo)物均可出峰，但考慮到較高的溫度對(duì)色譜柱使用壽命有一定的影響，故選擇25 ℃為最佳試驗(yàn)溫度。

2.3 提取溶劑的選擇

利用直接萃取法對(duì)萃取溶劑進(jìn)行對(duì)比。直接萃取法與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中提取著色劑使用的聚酰胺吸附法及提取禁用工業(yè)染料的濃縮萃取法相[20-21]比，前處理便捷，兼顧了10種色素的提取率。由于實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的5種水溶性人工合成著色劑(胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、酸性紅)和5種禁用工業(yè)染料(堿性嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙2)在水和醇類試劑中提取效果差異較大，為了保證良好的提取效果，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)[20-21]，以及其他檢驗(yàn)方法[11-18]設(shè)定不同的溶劑及提取比例。選取空白含量的液體果茶為基質(zhì)，配制7種提取溶劑。分別稱取14份樣品各5.0 g至50 mL離心管中進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，每種2個(gè)平行樣比對(duì)，分別加入25 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，并用相對(duì)應(yīng)的提取溶劑定容至25 mL。根據(jù)7種溶劑提取回收率發(fā)現(xiàn)，酸性紅、誘惑紅和酸性橙2在7種提取溶劑中提取效果比較穩(wěn)定。隨著甲醇比例的降低，堿性橙21、堿性橙2、堿性橙22、堿性嫩黃O四種極性較弱的化合物提取效果較差，回收率逐漸降低。但水溶液比例增大時(shí)，對(duì)極性較強(qiáng)的水溶性著色劑比較友好；反之，當(dāng)只使用色譜純甲醇進(jìn)行提取時(shí)，極性較強(qiáng)的水溶性化合物提取效果較差，回收率較低，但堿性橙21、堿性橙2、堿性橙22、堿性嫩黃O等極性較弱的化合物提取效果較好。當(dāng)使用氨化甲醇[20]進(jìn)行提取時(shí)，堿性嫩黃O和堿性橙22提取效果較差，回收率較低；當(dāng)使用甲醇∶水(7∶3)為萃取溶劑時(shí)，堿性橙22回收率較低；經(jīng)過比對(duì)，甲醇∶水(8∶2)時(shí)，10種化合物回收率均在85%以上，故選擇80%甲醇水作為最終試驗(yàn)提取溶劑(7種提取溶劑回收率比對(duì)結(jié)果見表2)。

表2 七種提取溶劑加標(biāo)回收率 單位：%Table 2 The recovery results of the 7 extraction solvents

2.4 蛋白沉淀劑添加量的影響

當(dāng)前國家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)豆制品中著色劑提取方法還未完善。實(shí)驗(yàn)采取溶劑萃取后進(jìn)行蛋白沉淀處理，由于豆制品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的大豆蛋白，若不對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀而上機(jī)檢測(cè)，容易有較多的雜質(zhì)，干擾降低其準(zhǔn)確性，造成色譜柱堵塞從而減短色譜柱使用壽命，故對(duì)豆制品進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀處理減少雜質(zhì)干擾。根據(jù)2.4小節(jié)中以果汁為基質(zhì)得出最佳提取溶劑為80%甲醇水，選取空白含量腐竹粉粹后作為基質(zhì)，以亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液為沉淀劑，對(duì)腐竹中的大豆蛋白進(jìn)行沉淀。分別稱取6份樣品分為3組，進(jìn)行加標(biāo)，每組包括加標(biāo)樣品與加標(biāo)平行樣品進(jìn)行對(duì)照，3組分別添加沉淀劑量0.5、1.0、2.0 mL(結(jié)果見圖4)。根據(jù)圖4中3組對(duì)比得出結(jié)論，當(dāng)沉淀劑添加量逐漸加大時(shí)，測(cè)定組分的回收率有一定幅度的降低。當(dāng)選擇加入0.5 mL沉淀劑時(shí)，回收率超過75%，故選擇2種沉淀劑的添加量為0.5 mL。

圖4 沉淀劑不同添加量回收率對(duì)比Fig 4 Comparison of recovery rate of different precipitants added

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)每種組分的截距和斜率計(jì)算得出線性回歸方程，線性范圍見1.3小節(jié)中配制出的標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出每種測(cè)定組分相關(guān)性均>0.999，顯示線性良好。以S/N=3為基準(zhǔn)，得出方法檢出限，以S/N=10為基準(zhǔn)，得出方法定量限結(jié)果見表3。根據(jù)公式(1)計(jì)算出樣品最終含量。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, linear range, detection limit, quantification limit

(1)

式中：x，試樣中各組分的含量；mg/kg；ρ，試樣溶液各得測(cè)組分的濃度，μg/mL；V，試樣提取液的體積，mL；m，試樣的質(zhì)量，g。

以茶飲料為基質(zhì)，分別取1、5、10 mg/kg三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)，計(jì)算其回收率，10種組分平均回收率均>85%；日內(nèi)精密度RSD值為0.76%～4.10%，日間精密度RSD為1.09%～5.29%(結(jié)果見表4)。結(jié)果表明儀器重復(fù)性及再現(xiàn)性良好。

表4 平均回收率、日內(nèi)精密度(n=6)、日間精密度(n=6)Table 4 Average recovery rate, intra-day precision (n=6), inter-day precision (n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了對(duì)飲料、配制酒及干制豆制品中的5種偶氮類著色劑和5種工業(yè)染料同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法，對(duì)3種不同類型的食品前處理方法及測(cè)定的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)當(dāng)前國標(biāo)中未能對(duì)食品中著色劑和工業(yè)染料同時(shí)提取這一缺點(diǎn)進(jìn)行了研究。與我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)相比，前處理過程更加便捷，回收率良好，大大的節(jié)省時(shí)間與耗材，根據(jù)方法學(xué)驗(yàn)證表明結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高，為檢測(cè)食品中色素含量提供了可靠依據(jù)。