楊帆，蘇卜利，王永紅，張玉蓮，黃樺瑞，張秀秀，朱紅惠

(廣東省微生物研究所，廣東省科學院，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物菌種保藏中心，廣東 廣州， 510070)

番茄紅素是一類具有較強抗氧化性的類胡蘿卜素，國際上相關產品研發(fā)已經成為新藥研究的熱點。番茄紅素的生產方法主要包括植物提取法、化學合成法以及發(fā)酵法。由于提取法以西紅柿等為原料來萃取，成本過高，而化學合成法中殘留的化學試劑對番茄紅素品質有一定影響，相比之下發(fā)酵法是最具潛力的生產方法[1-3]。

目前，國內外對于番茄紅素的研究主要集中在代謝途徑的改造與調控等方面[4]。ZHU等[5]在構建大腸桿菌中異源表達甲羥戊酸途徑，經100 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后產量達到了34.3 mg/g DCW。JIN等[6]通過對代謝途徑相關基因進行組合與敲除，成功篩選到1株產量提高近4倍的高產菌株。這些研究中大多采用誘導型啟動子，需要添加誘導劑來進行表達，造成生產工藝復雜、成本較高等問題。由于大腸桿菌中性能優(yōu)良的組成型啟動子較少，無法滿足代謝調控的需要。因此，本研究利用番茄紅素的合成作為表征系統(tǒng)，對大腸桿菌啟動子進行篩選。

啟動子是基因表達調控的順式作用元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。外源基因在大腸桿菌中表達的強弱主要取決于表達載體中啟動子的性能。啟動子在轉錄水平上所發(fā)揮的重要作用，不僅決定了基因的表達水平，也決定了基因表達的時空順序[7-9]。大腸桿菌染色體上也存在著許多調控其自身基因表達的啟動元件，這些啟動子也可以應用于外源基因的表達調控[10]。根據(jù)文獻報道，大腸桿菌中一些受轉錄因子調控的基因，其啟動子表現(xiàn)出較高的表達強度。這是由于含有這類啟動子的質粒在宿主中σ32濃度水平較正常細胞要高, 可以提高重組菌的表達水平[11]，有利于外源基因的轉錄[12]，提高目標產物的產量。

本課題組在前期研究中構建了1株能夠生產番茄紅素的大腸桿菌工程菌pTrc99aEBI。由于pTrc99a屬于誘導型質粒，會增加生產番茄紅素的工藝流程和生產成本，不利于未來的工業(yè)化生產。因此在本研究中，通過選擇大腸桿菌中17個轉錄因子相關基因的啟動子序列，以編碼番茄紅素合成基因的CrtEBI為報告基因，通過構建表達番茄紅素合成基因的組成型質粒，優(yōu)化番茄紅素的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

克隆菌株EscherichiacoliDH5α及表達菌株E.coliBL21(DE3)，廣東省微生物研究所；pACYCDuet-1質粒，本實驗室；PCR引物及目的基因，蘇州金唯智公司；胰蛋白胨、酵母粉，Oxoid 公司；DNA marker、Primer Star Max、DNA polymerase PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer，Takara公司；質粒提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；番茄紅素標準品(色譜純)，北京索萊寶科技有限公司；其他藥品或試劑，進口或國產分析純或色譜純。

1.1.2 實驗儀器

PCR儀、離心機，Eppendorf公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和溶液的配制

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂15。

抗生素工作質量濃度：氯霉素34 mg/L，氨芐青霉素 50 mg/L；誘導劑工作濃度：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG) 0.1 mmol/L。

1.2.2 菌株和質粒

本實驗所用菌株和質粒如表1所示。

表1 本研究使用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2.3 目的基因的克隆

以實驗室保存的基因組或空載體為模版，按表2中相應的配對引物，分別通過PCR擴增得到載體片段pACYCDuet-1、目的基因CrtEBI及啟動子片段Pskp、Posmy、Phdea、Pyifa、Plpp、Pompf、Pmglb、Prpoh、Pmarr、Pihfb、Pfnr、Pfkpa、Pdnak、Parca、Prpod、Prpof、Pgros。

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.4 產番茄紅素質粒的構建

將啟動子片段、目的基因片段以及載體片段進行瓊脂糖凝膠電泳并回收。通過重疊PCR方法將目的基因片段CrtEBI與啟動子片段進行連接，切膠回收后獲得PX-CrtEBI。使用CPEC等[13]的方法將PX-CrtEBI與載體pACYCDuet-1進行連接，連接體系：目的基因與載體各2.5 μL、Primer Star Max DNA polymerase 5 μL。連接條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，DpnΙ消化質粒模板后轉化E.coliDH5α。在含氯霉素抗性的平板上進行篩選，待培養(yǎng)約12 h后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。將驗證正確的菌體進行培養(yǎng)，提取質粒，送上海美吉公司進行測序，經測序正確的重組質粒命名為pACYC-Px-CrtEBI。

1.2.5 重組菌株的構建及番茄紅素的生產

將質粒pACYC-Px-CrtEBI轉入E.coliBL21(DE3)中，同時以99aEBI菌株作為對照菌株，分別在含有氯霉素、氨芐青霉素的LB平板上進行篩選。挑取單克隆至5 mL含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下進行培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)后轉接至50 mL含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；99aEBI對照菌株待菌體長至OD值大約0.6～0.8，添加IPTG進行誘導，轉至30 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)，約發(fā)酵20 h后檢測番茄紅素含量。

1.2.6 番茄紅素的提取與測定

番茄紅素的提取與測定參照SUN等[14]的方法。具體操作：取3 mL培養(yǎng)至一定時間的培養(yǎng)液，5 000 r/min離心3 min棄上清液；用無菌水清洗2次，加3 mL丙酮，于55 ℃水浴鍋中萃取15 min，5 000 r/min離心5 min取上清液即為番茄紅素萃取液，保留上清液以備檢測。另外取9 mL培養(yǎng)液于8 000 r/min 離心5 min后棄上清液，菌體于70 ℃烘干，然后計算菌體干質量。

用超純水配制質量濃度分別為1、2、4、6、12、14、16和18 μg/mL的番茄紅素標準溶液，取一定量的番茄紅素標準溶液和樣品一起采用HPLC進行測定。色譜柱：反相色譜柱C18；流動相：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(異丙醇)=80∶15∶5；流速1.2 mL/min；檢測波長472 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。以番茄紅素標準品繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算番茄紅素的產量。

2 結果與分析

2.1 目的基因的獲得

以本實驗室保存的質?；蚧蚪MDNA為模板，依次用表2中的引物，分別通過PCR擴增得到載體片段pACYCDuet-1、目的基因CrtEBI及啟動子片段Pskp、Posmy、Phdea、Pyifa、Plpp、Pompf、Pmglb、Prpoh、Pmarr、Pihfb、Pfnr、Pfkpa、Pdnak、Parca、PrpoD、PrpoF、Pgros并用瓊脂糖凝膠電泳回收，已知各基因大小分別為4008、3657、588、580、579、582、581、584、580、590、587、593、591、588、589、589、586、587和587 bp。再將啟動子片段與CrtEBI進行連接獲得PX-CrtEBI片段。PCR結果與啟動子基因的大小吻合，所得的核酸電泳圖如圖1所示。

M-Marker;1-pACYCDuet-1; 2-CrtEBI; 3-Pskp; 4-Posmy; 5-Phdea; 6-Pyifa; 7-Plpp; 8-Pompf; 9-Pmglb; 10-Prpoh; 11-Pmarr; 12-Pihfb; 13-Pfnr; 14-Pfkpa; 15-Pdnak; 16-Parca; 17-PrpoD; 18-PrpoF; 19-Pgros圖1 目的基因及不同啟動子PCR擴增產物核酸電泳圖Fig.1 Nucleic acid electrophoresis of the target genes and different promoters PCR products

2.2 重組質粒的構建

將切膠回收的PX-CrtEBI與載體pACYCDuet-1進行連接，構建合成番茄紅素的pACYC-Px-CrtEBI質粒。將該質粒轉化E.coliDH5α，待培養(yǎng)后提取質粒送測序，測序結果用軟件Vector NT1進行比對，比對結果表明各個質粒均構建成功。

2.3 番茄紅素標準曲線

根據(jù)相應質量濃度番茄紅素樣品對應的峰面積，可以得到其數(shù)學關系式為：Y=0.028 6X-0.196 8，R2=0.997 2，其中Y為番茄紅素質量濃度，X為峰面積。

2.4 不同啟動子對番茄紅素產量的影響

將含有番茄紅素合成基因的pACYC-Px-CrtEBI質粒轉入E.coliBL21(DE3)中，同時以99aEBI菌株作為對照菌株。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20 h后提取番茄紅素。以番茄紅素的產量作為指標，來比較不同啟動子強度對番茄紅素產量的影響。在大腸桿菌中表達不同啟動子的重組質粒，番茄紅素產量有一定的差異，有些效果較好的啟動子會提高番茄紅素產量，而也有一些效果較差的啟動子會降低番茄紅素產量。

經過搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵后，挑取效果較好的Pskp、Plpp、Pmglb、Prpoh、Pihfb、Pfnr和Pgros菌株進行HPLC檢測番茄紅素產量，結果如圖2所示。在重組菌株中，以Plpp和Pmglb為啟動子的菌株番茄紅素產量顯著提高，產量分別可以達到7.03和7.20 mg/g DCW。與對照菌株99aEBI產量(4.76 mg/g DCW)相比，菌株番茄紅素產量分別提高了約47.7%、51.3%。而以Pihfb、Pgros為啟動子的菌株番茄紅素產量顯著降低，沒有達到預期效果。以Pskp、Pfnr為啟動子的菌株產量提升則不夠顯著。

圖2 不同啟動子菌株產番茄紅素情況Fig.2 Production of lycopene by strain with different promoter注：NS表示P>0.05; *表示P<0.05; ***表示P<0.001

3 討論

啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始mRNA合成的序列，是基因表達不可缺少的重要調控序列[15]。強啟動子可用于表達質粒載體的構建以及在工程菌中代替目標基因自身的啟動子[16-19]。代謝工程關于啟動子的研究中，胡于東[20]在氧化葡萄糖酸桿菌中發(fā)現(xiàn)了高強度啟動子Pdnak，有效縮短了山梨醇的轉化時間并使山梨糖產量提高了約11.2%；王玲玲等[21]通過在大腸桿菌中篩選高表達啟動子來提高菌株生產維生素B12的能力，使其產量提高了39.7%；陳坤等[22]在地衣芽孢桿菌基因組中篩選獲得1種新型組成型啟動子，該啟動子的表達強度分別是對照菌株的1.25和2 倍。

在提高類胡蘿卜素產量的研究中，翁志明[23]通過對dxs基因啟動子的置換將番茄紅素的產量提高到15.6 mg/g DCW，相比于對照菌株提高了約13%；謝文平[24]利用類胡蘿卜素的色度進行表征，比較了不同代謝途徑相關啟動子的強度，發(fā)現(xiàn)不同啟動子之間的強度差距能夠達到約20倍；YUAN等[25]利用同源重組的方法，將MEP 途徑中關鍵基因dxs、idi、ispB和ispDF的啟動子替換為T5強啟動子，β-類胡蘿卜素產量分別提高了100%、40%、20%和40%。再用T5啟動子同時對這4個基因進行組合調控，產量提高了6.3 倍。SUH[26]也通過利用強啟動子T5來調控MEP途經，使β-類胡蘿卜素的產量提高了約4.5倍。

相比于文獻報道中常用的誘導型啟動子，采用組成型啟動子可以不添加誘導物來控制目標基因的表達。因此，構建組成型質粒來過表達目標基因具有成本低、工藝簡單的特點。但目前大腸桿菌中性能優(yōu)良的組成型啟動子較少，無法滿足代謝調控的需求。因此，篩選組成型啟動子成為提高番茄紅素產量的重要環(huán)節(jié)。為了獲得高產番茄紅素的組成型啟動子，本研究克隆大腸桿菌中轉錄因子相關基因的啟動子區(qū)域，構建表達番茄紅素合成基因的組成型質粒，提高合成番茄紅素的表達水平，改良前期誘導型質粒的缺點，以達到提高番茄紅素產量和優(yōu)化生產工藝的目的。

4 結論

本研究從大腸桿菌基因組中篩選到具有高表達量且無需添加誘導劑的啟動子Plpp、Pmglb，以編碼番茄紅素合成基因的CrtEBI為報告基因，對其表達活性進行研究。實驗結果表明，重組菌Plpp、Pmglb番茄紅素產量分別約為7.03、7.20 mg/g DCW，相較于對照菌株產量分別提高了47.7%、51.3%，實現(xiàn)了提高番茄紅素產量的目標。同時，由于篩選到組成型啟動子，省去了添加誘導劑的過程，達到了優(yōu)化生產工藝的目的。