鄭 翔，徐杰杰，張佳佳，王 濤，尹紹武

( 南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023 )

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)屬鲇形目，鲿科，黃顙魚屬，主要分布于長江及其支流中。該品種不僅具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、耐低溫、抗病力強(qiáng)和食性雜等優(yōu)點，且肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價值高[1-3]，在土著經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖的發(fā)展過程中越來越受到重視。由于長江流域瓦氏黃顙魚大量捕撈，資源嚴(yán)重銳減，因此，采取各種措施保護(hù)長江流域的瓦氏黃顙魚種質(zhì)資源，是瓦氏黃顙魚種質(zhì)資源可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。深入研究該物種的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性是科學(xué)制定資源保護(hù)與開發(fā)規(guī)劃的基礎(chǔ)。迄今為止，關(guān)于瓦氏黃顙魚的研究主要集中在其繁殖、養(yǎng)殖技術(shù)、低氧生理和營養(yǎng)價值分析等方面，對于我國瓦氏黃顙魚遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性的研究尚未引起重視。而瓦氏黃顙魚主要分布于我國長江水域。筆者選取長江上、中、下流域共4個支流的瓦氏黃顙魚群體為研究對象，探究不同地區(qū)瓦氏黃顙魚群體的遺傳多樣性，以期為長江水系瓦氏黃顙魚的保護(hù)性開發(fā)、良種選育等提供理論依據(jù)。

微衛(wèi)星DNA又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單重復(fù)序列[4]，是一種在真核生物基因組中廣泛分布的DNA片段。每個微衛(wèi)星DNA均由核心序列和側(cè)翼序列兩部分組成，其核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列，側(cè)翼序列為單拷貝序列，位于核心序列的兩端，具有保守性，能特異地將不同的微衛(wèi)星定位于基因組特定部位。利用微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性及核心序列的高突變性、拷貝豐富性設(shè)計引物，可通過對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來探究物種內(nèi)微衛(wèi)星位點的多態(tài)性。隨著國內(nèi)外學(xué)者對其結(jié)構(gòu)、遺傳特性及發(fā)生機(jī)理等研究的不斷深入，微衛(wèi)星技術(shù)在構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、定位數(shù)量性狀座位、評估遺傳多樣性、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、疾病診斷及血緣關(guān)系鑒定等[5-8]方面顯示出巨大優(yōu)勢，并因其數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富及檢測快速方便而廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性的研究。目前，國內(nèi)外關(guān)于黃顙魚屬魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記研究主要集中在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，而關(guān)于瓦氏黃顙魚的微衛(wèi)星標(biāo)記鮮見報道。劉紅艷等[9]采用10個微衛(wèi)星位點對長江中、下游5個湖泊和云南撫仙湖黃顙魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析；李景芬等[10]采用篩選的6個微衛(wèi)星標(biāo)記分析了黃顙魚、瓦氏黃顙魚以及黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚(♂)雜種一代3個群體的遺傳特征；張秀杰[11]對采集于4個水系的12個野生黃顙魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并采用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了黃顙魚的第一代遺傳連鎖圖譜；孔藝[12]采用鏈霉素磁珠法分離篩選微衛(wèi)星標(biāo)記，分析了長江中下游部分黃顙魚群體的遺傳多樣性。

筆者利用篩選出的25對多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物對嘉陵江、沅江、漢水、贛江4個瓦氏黃顙魚群體進(jìn)行遺傳多樣性比較分析，為不同瓦氏黃顙魚群體遺傳評估和新品種選育提供了理論基礎(chǔ)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為嘉陵江(位于長江上游)瓦氏黃顙魚野生群體32尾，沅江(位于長江中游)瓦氏黃顙魚野生群體32尾，漢水(位于長江中游)瓦氏黃顙魚野生群體31尾，贛江(位于長江下游)瓦氏黃顙魚野生群體32尾，共127尾瓦氏黃顙魚個體。具體地理位置見表1、圖1，分別取127尾個體的尾鰭保存于無水乙醇中，置于冰箱中-20 ℃冷藏備用。

表1 4個瓦氏黃顙魚群體的采樣信息

圖1 4個瓦氏黃顙魚群體的地理位置

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測

使用上海捷瑞生物公司的細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)進(jìn)行瓦氏黃顙魚DNA的提取，將提取的DNA經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓120 V，電流165 A，時間22 min)檢測，在凝膠成像儀中拍攝電泳圖片觀測樣品DNA的完整性與純度，最后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物

自瓦氏黃顙魚轉(zhuǎn)錄組EST序列篩選獲得80個微衛(wèi)星位點，經(jīng)過電泳儀條帶檢驗其中有48對能夠在4個群體中穩(wěn)定擴(kuò)增，挑選等位基因數(shù)較多、多態(tài)性較好的25對引物用于瓦氏黃顙魚群體的遺傳分析，試驗所采用的引物及4種熒光染料(FAM、HEX、TAMRA及ROX)(表2)由擎科生物公司(南京合成部)合成。

表2 試驗所采用的25對微衛(wèi)星引物的特征

(續(xù)表2)

1.2.3 PCR擴(kuò)增及檢測

25對引物分別對4個瓦氏黃顙魚群體DNA基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：10 μL反應(yīng)體系含模板1 μL DNA，5 μL 2×Taq Mix，10 μmol/L正向引物0.04 μL，10 μmol/L反向引物0.16 μL，10 μmol/L熒光基因0.16 μL，和3.64 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測到有單一條帶的產(chǎn)物上樣于ABI3500xl分析儀(上海生工公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測產(chǎn)物片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GeneMarker 1.97軟件分析微衛(wèi)星位點的片段長度；利用POPGENE 1.32軟件分析微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、Nei氏遺傳距離以及遺傳相似度；利用PIC_CALC計算多態(tài)信息含量(PIC)；根據(jù)群體間的Nei氏遺傳距離，用MEGA 5.0軟件非加權(quán)組平均法構(gòu)建群體間聚類圖；利用Arqlequin 3.1計算成對遺傳分化指數(shù)并進(jìn)行分子方差分析；利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體間的貝葉斯聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個瓦氏黃顙魚群體的遺傳多樣性分析

用經(jīng)過篩選的微衛(wèi)星引物對4個瓦氏黃顙魚群體127尾個體分別進(jìn)行遺傳多樣性分析，25個位點中的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量及其各個群體的平均值見表2。漢水群體的平均有效等位基因為3.578、平均期望雜合度為0.674、多態(tài)信息含量為0.624，在4個瓦氏黃顙魚群體中最高。相反，嘉陵江群體的平均有效等位基因為2.383、平均期望雜合度為0.487、多態(tài)信息含量為0.431，在4個瓦氏黃顙魚群體中最低。

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.2 4個瓦氏黃顙魚群體的遺傳距離和遺傳相似度

瓦氏黃顙魚群體間Nei氏遺傳距離為0.641～2.140，遺傳相似度0.073～0.525(表3)。其中沅江和漢水的群體間的遺傳距離最近(0.641)，遺傳相似度最高(0.525)，而嘉陵江和贛江群體之間的遺傳距離最遠(yuǎn)(2.140)，遺傳相似度最低(0.073)。

表3 4個瓦氏黃顙魚屬魚類的遺傳多樣性信息

2.3 4個瓦氏黃顙魚群體的聚類分析結(jié)果及方差分析

依據(jù)4個瓦氏黃顙魚群體的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離(表4)，用非加權(quán)組平均法對4個群體進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，沅江和漢水瓦氏黃顙魚群體先聚為一類，然后和嘉陵江瓦氏黃顙魚聚為一類；贛江瓦氏黃顙魚單獨(dú)聚為一類。由于沅江和漢水均位于長江中游，相互連通，很可能水域之間的連通及地理位置是影響其聚類的原因(圖2)。

圖2 4個瓦氏黃顙魚群體的聚類分析

表4 4個瓦氏黃顙魚群體的Nei氏遺傳距離與遺傳相似度

分子方差分析結(jié)果(表5)表明，群體中有31.04%(P<0.01)的遺傳變異來自于群體間，68.96%(P<0.01)的遺傳變異來自于群體內(nèi)，表明遺傳變異大部分存在于個體之間，群體內(nèi)的遺傳變異大于群體間的遺傳變異。4個瓦氏黃顙魚群體間的遺傳分化指數(shù)為0.1613～0.4020(表6)，屬于較高水平遺傳分化(遺傳分化指數(shù)>0.15)。其中嘉陵江瓦氏黃顙魚群體和贛江瓦氏黃顙魚群體之間的遺傳分化水平最低，遺傳分化指數(shù)0.1613，屬于較大程度的分化(0.15<遺傳分化指數(shù)<0.25)。而嘉陵江瓦氏黃顙魚群體和漢水瓦氏黃顙魚群體之間遺傳分化水平最高，遺傳分化指數(shù)0.4020，兩者間的分化程度極大(遺傳分化指數(shù)>0.25)(表6)。

表5 4個瓦氏黃顙魚群體的方差分析

表6 4個瓦氏黃顙魚群體的遺傳分化指數(shù)

利用Structure 2.3.4軟件對4個瓦氏黃顙魚群體25個微衛(wèi)星座位等位基因數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯聚類分析與遺傳結(jié)構(gòu)推導(dǎo)分析(圖3)。按照文獻(xiàn)[13]計算最優(yōu)K值的方法，得到當(dāng)K=3時，沅江和漢水群體在遺傳結(jié)構(gòu)上相似，可為一類；嘉陵江和贛江各為一類。

圖3 4個瓦氏黃顙魚群體的Structure 2.3.4遺傳結(jié)構(gòu)

3 討 論

遺傳多樣性是衡量群體的資源豐富狀況的一個重要根據(jù)，也是物種在應(yīng)對不同的環(huán)境條件下能保證穩(wěn)定存活和遺傳進(jìn)化的基礎(chǔ)[14]。群體的遺傳多樣性程度與對環(huán)境的適應(yīng)能力、自身進(jìn)化的潛力呈正相關(guān)[15-17]。微衛(wèi)星標(biāo)記之所以成為當(dāng)前研究者最為常用的分子生物學(xué)方法之一，是因其微衛(wèi)星具有按照孟德爾方式分離、呈共顯性遺傳、在數(shù)量方面沒有生物上的限制、多態(tài)性高和引物通用性強(qiáng)等優(yōu)點[18-19]。本研究中的80對瓦氏黃顙魚微衛(wèi)星引物，其中能在4個瓦氏黃顙魚群體進(jìn)行有效擴(kuò)增的有48對，擴(kuò)增率達(dá)60%，擴(kuò)增結(jié)果較為良好。在本研究中選用25對多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物對4個群體進(jìn)行遺傳分析，可為瓦氏黃顙魚群體遺傳多樣性分析和遺傳資源的收集、鑒定、保護(hù)和合理利用提供資料。

3.1 多態(tài)信息含量及基因雜合度的影響

多態(tài)信息含量用來描述微衛(wèi)星位點遺傳變異程度，含量的高低與變異程度成正比。根據(jù)文獻(xiàn)[20]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，在某一群體中，當(dāng)多態(tài)信息含量>0.5時，該位點表現(xiàn)為高度多態(tài)；當(dāng)0.25<多態(tài)信息含量<0.5時，該位點表現(xiàn)為中度多態(tài)；當(dāng)多態(tài)信息含量<0.25時，該位點表現(xiàn)為低度多態(tài)。本研究中，嘉陵江、沅江、漢水、贛江4個群體得到的平均多態(tài)信息含量為0.431～0.627，表現(xiàn)為高度多態(tài)的位點分別為9、11、23、21個，中度多態(tài)的位點分別為12、11、3、5個。表明瓦氏黃顙魚群體的微衛(wèi)星側(cè)翼序列在同種間具有保守性，其遺傳變異程度高，遺傳多樣性比較豐富，并且良種選育潛力在漢水群體中表現(xiàn)的尤為突出。

基因雜合度是衡量群體遺傳變異的最適參數(shù)，代表著群體中雜合子在某個位點上的頻率，體現(xiàn)群體的進(jìn)化程度[21]。Takezaki等[22]通過對微衛(wèi)星標(biāo)記的研究發(fā)現(xiàn)，群體具有遺傳多樣性的基礎(chǔ)是雜合度的數(shù)值>0.3。雜合度可分為觀測雜合度和期望雜合度，當(dāng)觀測雜合度值與期望雜合度值相近時，表明外部環(huán)境選擇及近交等因素對該物種遺傳變異情況的影響較小，此時群體內(nèi)處于遺傳平衡狀態(tài)[23]。也可根據(jù)公式d=(Ho-He)/He(Ho為觀測雜合度，He為期望雜合度)判斷群體的遺傳變異狀態(tài)，其中d為每個群體的遺傳偏離指數(shù)，當(dāng)d值靠近0時，說明基因型分布接近于平衡狀態(tài)；當(dāng)d值偏離0時，說明基因型分布偏離平衡狀態(tài)，d值大于0時說明雜合子過剩，d值小于0時說明雜合子缺失。本研究中檢測的瓦氏黃顙魚嘉陵江、沅江、漢水和贛江群體的平均觀測雜合度分別為0.460、0.494、0.581、0.491，平均期望雜合度分別為0.487、0.532、0.674、0.665，表明4個地理群體瓦氏黃顙魚均具有較高的遺傳多樣性，有較好的選育潛力。4個地理群體平均觀測雜合度比平均期望雜合度低，推測可能是由于近交情況的普遍存在而使群體發(fā)生純合，進(jìn)而導(dǎo)致雜合度降低。嘉陵江群體的期望雜合度值略低于其觀測雜合度，說明該群體相對于其他3個群體來說遺傳性較為穩(wěn)定。相反，贛江群體的觀測雜合度和期望雜合度相差最大，原因可能是該地區(qū)有大量養(yǎng)殖個體放流，由于具有單一的遺傳背景，逃逸的養(yǎng)殖個體與野生種進(jìn)行雜交使雜合子缺失，從而使遺傳平衡遭到破壞。因此，在繁殖選育過程中應(yīng)盡量擴(kuò)大選育范圍，避免具有同樣遺傳背景的群體之間的交配，也要防止大量養(yǎng)殖個體的放流逃逸。此外，影響試驗結(jié)果的因素也可能是多態(tài)性微衛(wèi)星位點的挑選和取樣數(shù)量的多少。

3.2 遺傳距離與遺傳相似系數(shù)的影響

遺傳距離是衡量群體間遺傳關(guān)系的指標(biāo)，遺傳相似系數(shù)是衡量群體間遺傳變異程度的可靠參數(shù)。群體間親緣關(guān)系與其遺傳距離和遺傳相似系數(shù)有直接關(guān)系，當(dāng)群體間親緣關(guān)系越近時，則遺傳距離越近，遺傳相似系數(shù)就越大[24]。當(dāng)遺傳相似系數(shù)大于0.5時，此時群體間的親緣關(guān)系為一級親緣關(guān)系[25]。由于相關(guān)的微衛(wèi)星是純合體，且部分含有相同的片段長度，可能會得到高出理論值的遺傳相似系數(shù)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，沅江和漢水的群體間的遺傳距離最近(0.641)，遺傳相似度最高(0.525)，達(dá)到一級的親緣關(guān)系；而嘉陵江和贛江群體之間的遺傳距離最遠(yuǎn)(2.140)，遺傳相似度最低(0.073)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。說明這種親緣關(guān)系可能與群體的地理位置分布有關(guān)。

Structure軟件是在取樣個體的遺傳構(gòu)造的基礎(chǔ)上對所在群體遺傳結(jié)果進(jìn)行模擬分析，其具有不受取樣數(shù)量影響的特點，是群體結(jié)構(gòu)遺傳分析的理想工具[27-28]。本試驗對4個地理群體進(jìn)行結(jié)構(gòu)遺傳分析，結(jié)果符合UPGMA樹的聚類統(tǒng)計，嘉陵江群體和沅江群體聚為一類，說明2個群體之間的遺傳結(jié)構(gòu)相似，從結(jié)構(gòu)分析圖中可以看出，嘉陵江群體與沅江群體存在著一定程度的基因交換，這可能與長江上游中游兩個流域存在著一定的親魚或苗種互相供給與交流有關(guān)。贛江群體單獨(dú)為一支，可能是由于贛江與長江下游湖泊相連，之前長江下游的湖泊與長江相通，現(xiàn)在都變?yōu)榧竟?jié)通江或不通江，這一過程(加上其他因素)使贛江群體與長江其他流域的瓦氏群體的基因交流較少。

3.3 遺傳分化指數(shù)的影響

遺傳分化指數(shù)是表征群體間的遺傳分化尺度。當(dāng)遺傳分化指數(shù)<0.05時，說明群體間的遺傳分化較弱；當(dāng)0.05<遺傳分化指數(shù)<0.15時，群體屬于中等程度的遺傳分化；當(dāng)0.15<遺傳分化指數(shù)<0.25時，則群體間存在較大的遺傳分化；當(dāng)遺傳分化指數(shù)>0.25時，說明群體間分化極大[21]。本試驗中4個群體的遺傳分化指數(shù)為0.1613～0.4020，群體之間屬于較大程度的遺傳分化，其中嘉陵江群體與漢水群體之間的遺傳分化水平最高，遺傳分化指數(shù)為0.4020，兩者間的分化程度極大(遺傳分化指數(shù)>0.25)。同時分子方差分析結(jié)果表明，遺傳變異大部分來源于內(nèi)部個體之間，來自于群體之間的變異占31.04%。

綜上所述，利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究表明，長江流域的4個瓦氏黃顙魚群體間存在一定的遺傳分化，每個群體內(nèi)遺傳變異較大，且遺傳多樣性均較豐富，可作為家系選育的基礎(chǔ)群體。郭金峰等[29]利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究了3個山東境內(nèi)黃顙魚群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，并計算了遺傳相似性指數(shù)和遺傳分化程度，以及對構(gòu)建的UPGMA樹的分析，結(jié)果表明，3個黃顙魚群體多態(tài)信息含量整體水平較高，遺傳多樣性較為豐富。吳勤超等[30]采用磁珠富集法篩選出10個黃顙魚微衛(wèi)星標(biāo)記，并對長江中上游流域3個野生黃顙魚群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了微衛(wèi)星分析，結(jié)果也很清晰地顯示出3個群體具有很高的遺傳多樣性水平。以上研究結(jié)果表明，微衛(wèi)星技術(shù)在鑒定大樣本物種的種間差異性和種內(nèi)多樣性上具有極大的優(yōu)勢，結(jié)合本次試驗的結(jié)果，為長江流域黃顙魚屬的遺傳多樣性研究提供了有價值的參考資料。本試驗顯示，嘉陵江瓦氏黃顙魚群體較其他3個群體遺傳多樣性最低，其原因可能是本群體野生資源量少而導(dǎo)致瓶頸效應(yīng)，遺傳背景的單一等，導(dǎo)致多樣性的水平下降[31]。也可能是受核質(zhì)作用的影響[32]。在今后的育種工作中，可以利用不同群體不同個體間的遺傳距離及聚類圖來輔助進(jìn)行繁殖配組，指導(dǎo)建立家系或群體選育[33]，通過計算不同個體間的遺傳距離，使群體建立親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的繁育群組，最大限度地避免近親交配，同時也保持群體多樣性，這對于提高該魚遺傳育種潛力、縮短育種年限和加快新品種的選育具有十分重要的意義[34]。