陳美群，王冬平，潘瑛子，張 馳，扎西拉姆，田 云

( 1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128 )

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)為腸桿菌科、鄰單胞菌屬內(nèi)唯一種[1]，廣泛分布于自然界，是一種全球性分布細(xì)菌，水生態(tài)環(huán)境是其主要儲(chǔ)存地，而魚類是其常見宿主，可通過受污染的水、魚及貝類感染人類[2-6]。類志賀鄰單胞菌是一種人—獸—魚共患病原菌[7]，可導(dǎo)致魚類等水產(chǎn)動(dòng)物疾病頻發(fā)，同時(shí)也可引起人類的腸胃炎、敗血癥、腦膜炎、腹瀉和食物中毒等疾病[8-10]，因此受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

1 分類和命名

類志賀鄰單胞菌最早由Ferguson等[11]于1947年從一位腸胃炎患者糞便中分離得到，被標(biāo)志為C27副大腸菌，屬腸桿菌科。1957年根據(jù)其有端生鞭毛的特征將其歸入假單胞菌屬(Pseudomonas)，改稱為類志賀假單胞菌(Pseudomonasshigelloides)[12]。1962年Habs等研究發(fā)現(xiàn)，此菌在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖，形態(tài)上并不嚴(yán)格呈逗點(diǎn)狀、端生鞭毛，不產(chǎn)明膠酶、蛋白酶、脫氧核糖核酸酶等胞外酶的特性，將其歸為弧菌科的一個(gè)新屬(即鄰單胞菌屬)，由于該菌與宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)Ⅰ型有共同抗原，故命名為類志賀鄰單胞菌[13]。該菌曾長(zhǎng)期被劃歸到弧菌科，后隨著脫氧核糖核酸雜交、全基因組序列分析等多相分類鑒定技術(shù)的發(fā)展，在2005年第二版《伯吉氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中，又將類志賀鄰單胞菌確立為腸桿菌科，鄰單胞菌屬的唯一種[1]。

2 生物學(xué)特性

2.1 形態(tài)特征

類志賀鄰單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，菌株為末端圓形直桿狀，無芽胞，莢膜或有或無[14-15]，大小通常為(0.8～1.0) μm×3.0 μm[15]，呈單、雙或短鏈狀排布，叢生鞭毛或單生鞭毛[13-15]。該菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、微隆起、表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊，不同來源的菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落顏色有差異，異育銀鯽來源的菌株菌落呈灰白色半透明狀菌落[15]，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)來源的菌株菌落呈米黃色半透明狀[16]，黑莓鱸(Pomoxisnigromacufastus)來源的菌株菌落呈淡黃色不透明[17]；在血瓊脂上菌落呈灰白色，一般無溶血現(xiàn)象[15]，偶有微溶血現(xiàn)象[16]；在麥康凱瓊脂菌落呈無色透明[15]；在沙門氏菌(Salmonella)—志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(SS瓊脂)上呈無色、圓形、半透明狀的小菌落，中心呈桔黃色[15]；在腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形、米黃色不透明，表面光滑濕潤(rùn)、微隆起、邊緣整齊[2]；在TSA瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形、白色不透明、表面濕潤(rùn)、中間凸起、邊緣整齊[5]；在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS)培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)[13]。不同來源的菌株或培養(yǎng)條件的差異都有可能會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞和菌落形態(tài)、鞭毛數(shù)目及著生情況發(fā)生變化[15]。

2.2 培養(yǎng)特性

類志賀鄰單胞菌為兼性厭氧菌，溫度、pH、氯化鈉含量對(duì)該菌的生長(zhǎng)均有影響。Miller等[18]研究表明，類志賀鄰單胞菌對(duì)溫度、pH、鹽度的適應(yīng)范圍較廣，在溫度8～45 ℃、pH 4.0～9.0的條件下均可生長(zhǎng)，耐受鹽度20.0～30.0，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較低。陳林等[14]研究斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)來源的類志賀鄰單胞菌的最適生長(zhǎng)條件，發(fā)現(xiàn)在不添加氯化鈉的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(pH 7.03)中，37 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度最快；鹽度為0～2.5的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中均可生長(zhǎng)，其中在鹽度1.5～2.0時(shí)生長(zhǎng)最好；在pH為5～10的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(含氯化鈉0.5 g)中均可生長(zhǎng)，其中以pH 6.5～8.0時(shí)生長(zhǎng)最好。 劉志剛等[19]對(duì)羅非魚來源的類志賀鄰單胞菌研究表明，該菌株在溫度25～37 ℃、pH 5.0～8.0和鹽度0～11內(nèi)生長(zhǎng)良好，其最適生長(zhǎng)條件為溫度37 ℃、pH 8.0和鹽度5。

2.3 主要生理生化特性

關(guān)于類志賀鄰單胞菌生理生化特征的研究較多，綜合相關(guān)研究總結(jié)類志賀鄰單胞菌主要生化特征為：氧化酶陽性，能分解發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸鹽還原、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶陽性。產(chǎn)吲哚，不產(chǎn)脂酶、色氨酸脫氨酶，明膠液化、V-P試驗(yàn)、硫化氫等指標(biāo)陰性(表1)，不同來源菌株間生化特征略有差異[5,14-17,19-21]。

表1 類志賀鄰單胞菌主要生理生化特征

2.4 血清型特征

1959年Sakazaki等[22]首先分析了類志賀鄰單胞菌的血清學(xué)分型，將22株類志賀鄰單胞菌分為5種菌體(O)抗原和4種鞭毛(H)抗原。1978年Shimada等[23]對(duì)87株類志賀鄰單胞菌進(jìn)行了血清學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了30個(gè)O抗原和11個(gè)H抗原，后續(xù)研究又將類志賀鄰單胞菌血清型發(fā)展到50種O抗原(O1～50)和17種H抗原[24]。1988年楊正時(shí)等[25]新發(fā)現(xiàn)了5種新的O 抗原(Oy51～Oy55)。2000年Aldová等[26]將類志賀鄰單胞菌血清學(xué)分型分為102種O抗原和51種H抗原。目前，我國(guó)對(duì)魚類來源的類志賀鄰單胞菌血清學(xué)分型研究較少，王宇等[27]將從鄭州集貿(mào)市場(chǎng)161份食用淡水魚類樣品中檢出的18株類志賀鄰單胞菌分為O3、O5、O15、O19、O27、O49等6種血清型。劉永大等[28]從撫順地區(qū)市售淡水魚中分離到123株類志賀鄰單胞菌分為21個(gè)血清型。梁玉裕等[29]對(duì)廣西地區(qū)類志賀鄰單胞菌調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)自人體檢出的11株類志賀鄰單胞菌分屬于O1、O4、O8、O13、O15、O35、O43等7種血清型，同時(shí)這些血清型從魚類或水體中均能檢出，說明人源菌株與魚類攜帶菌株有著密切聯(lián)系，類志賀鄰單胞菌可通過被污染的魚或水體而感染人類。

3 流行規(guī)律及致病特征

類志賀鄰單胞菌是一種條件致病菌，一旦環(huán)境適宜就會(huì)發(fā)生作用，發(fā)病后可對(duì)魚類等水產(chǎn)動(dòng)物造成極大危害，其感染死亡率高達(dá)60%～100%[14-15,21]。類志賀鄰單胞菌的適宜水溫為25～37 ℃，每年夏秋季(4—8月)為魚類疫情高發(fā)期[2,14,19]，并可通過被該病原菌污染的水體快速傳播，導(dǎo)致該病原菌的大范圍流行[14,20]。同時(shí)，該菌對(duì)溫度、pH、鹽度和營(yíng)養(yǎng)的適應(yīng)范圍較廣，使其在各種水體和不同季節(jié)均能存活[19]，筆者從西藏拉薩國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地(水溫12 ℃)人工馴養(yǎng)的患病西藏裂腹魚(Schizothoraxwaltoni)中也分離到該菌[30]。大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的魚類更易感染類志賀鄰單胞菌[2,31]，尤其是在成魚個(gè)體中，對(duì)魚苗也有一定的影響。攜菌魚類發(fā)病時(shí)出現(xiàn)急性大面積暴發(fā)和死亡的現(xiàn)象比較少，患病魚類從發(fā)病到死亡時(shí)間一般約 1～7 d[20]，部分魚類從感染類志賀鄰單胞菌到發(fā)病死亡可持續(xù)一個(gè)月之久[16]。

近年來，有關(guān)類志賀鄰單胞菌對(duì)魚類致病性的研究報(bào)道逐漸增多，該菌對(duì)不同魚類的致病癥狀稍有差異(表2)，這可能是由于魚種和養(yǎng)殖環(huán)境以及菌株差異所致。魚類感染初期主要表現(xiàn)為輕微浮頭和游動(dòng)無力，反應(yīng)遲鈍并伴有攝食減少的現(xiàn)象[20]。隨著感染程度的增加，魚類體表出現(xiàn)潰爛出血、肝臟腫脹并有出血點(diǎn)、魚鰭潰爛出血、腹腔有腹水、肛門紅腫有時(shí)伴有分泌物流出、膽囊和脾臟也有不同程度的腫大等癥狀(表2)。目前，關(guān)于魚源類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理研究較少。Ciznár等[32]通過分析不同來源的類志賀鄰單胞菌，明確該菌只產(chǎn)生低水平的彈性蛋白水解酶、蛋白酶和組氨酸脫羧酶，而三酰甘油脂肪酶活性相對(duì)較高，其毒力因子可能與菌的表面性質(zhì)主要是疏水性、鞭毛運(yùn)動(dòng)、組氨酸脫羧酶、三酰甘油脂肪酶和溶血性等相關(guān)。Tsugawa等[33]對(duì)類志賀鄰單胞菌細(xì)胞毒性外膜蛋白(ComP)的基本結(jié)構(gòu)和功能研究表明，ComP可能是引起感染后宿主細(xì)胞死亡的主要毒力因子。陳林等[14]從患病斑點(diǎn)叉尾來源的類志賀鄰單胞菌中也檢測(cè)到ComP基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有一定的致病力。Ekundayo等[34]采用比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，鄰單胞菌屬菌株的開放閱讀框(ORFs)與其他病原體中鑒定的毒力基因同源或直系同源，證實(shí)了類志賀鄰單胞菌具有致病能力，可能具有與腸外感染相關(guān)的毒力因子(VFs)。張明洋等[35]指出類志賀鄰單胞菌的毒力因子除類霍亂毒素、細(xì)胞毒素和溶血素外，還發(fā)現(xiàn)有2種熱穩(wěn)定性不同的腸毒素：類志賀鄰單胞菌的外毒素及菌體裂解釋放的內(nèi)毒素，可造成嚴(yán)重的組織損傷，這可能是該菌引起消化道病變的主要原因之一。劉志剛等[19]研究表明，類志賀鄰單胞菌感染尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)后，導(dǎo)致魚腸組織中腸絨毛膜上皮細(xì)胞脫落，局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮中杯狀細(xì)胞腫脹及數(shù)量增多；部分肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞核溶解，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化；脾臟組織中淋巴細(xì)胞增多，多點(diǎn)出血；腎臟組織中腎小管管壁細(xì)胞裂解，腎小管結(jié)構(gòu)被破壞；心肌細(xì)胞變大，細(xì)胞核增大，染色加深等。類志賀鄰單胞菌對(duì)魚類危害較大，有必要進(jìn)一步開展其致病機(jī)理方面的研究。

表2 類志賀鄰單胞菌的主要魚類來源及其致病特征

(續(xù)表2)

4 藥敏特性及防治措施

有關(guān)類志賀鄰單胞菌藥敏特性及毒力因子的研究報(bào)道較多，龍?zhí)K等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚致病性類志賀鄰單胞菌對(duì)先鋒Ⅵ、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、先鋒必、氟苯尼考等16 種藥物都高度敏感，對(duì)青霉素G和氨芐青霉素具有較強(qiáng)的耐藥性。劉志剛等[19]對(duì)尼羅羅非魚致病性類志賀鄰單胞菌的藥敏結(jié)果表明，該菌已呈現(xiàn)多重耐藥性，僅對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉等7種抗生素敏感。張效平等[5]發(fā)現(xiàn)，江鱈源類志賀鄰單胞菌對(duì)頭孢曲松、先鋒Ⅵ、卡那青霉素、慶大霉素等呈現(xiàn)多重耐藥特征，但對(duì)四環(huán)素、氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等13種藥物較敏感。楊虹等[45]對(duì)分離自廣東省不同地區(qū)的患病鱖魚(Sinipercachuatsi)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)和烏鱧(Channaargus)的55株類志賀鄰單胞菌研究表明，上述類志賀鄰單胞菌對(duì)克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、麥迪霉素、羧芐西林、苯唑西林的耐藥性較高，TEM、gyrB和tetR等耐藥基因檢出率分別為18.2%、67.3%和36.4%，其中39株致病菌至少含有1種耐藥基因。2018年Hossam等[46]首次報(bào)道了自1尾患病鲇魚中分離到的多重耐藥類志賀鄰單胞菌菌株MS-17-188的完整基因組序列，這對(duì)于研究該菌株耐藥的分子機(jī)制具有重要意義。Martins等[47]描述了從羅非魚中分離到1株耐四環(huán)素的類志賀鄰單胞菌FM82菌株的基因組草圖序列，該菌株攜帶有抗菌素耐藥性、生物膜和CRISPR相關(guān)基因。Martins等[48]報(bào)道，從巴西里約熱內(nèi)盧州的天然池塘魚體中分離到耐藥性較強(qiáng)的類志賀鄰單胞菌，其中大部分類志賀鄰單胞菌對(duì)四環(huán)素具有耐藥性，小部分對(duì)氯霉素耐藥，且這些耐藥類志賀鄰單胞菌均有耐四環(huán)素或氯霉素的耐藥基因。鄒升等[43]從環(huán)洞庭湖區(qū)患病草魚腸道中分離得到類志賀鄰單胞菌，該菌對(duì)紅霉素、多黏菌素、利福平、萬古霉素、氨芐西林、慶大霉素和卡那霉素產(chǎn)生較高的耐藥性，并檢測(cè)到S-核糖基高半胱氨酸酶和黏附素等毒力因子。豆朋朋等[44]對(duì)分離自患病黃顙魚的類志賀鄰單胞菌菌株L-1研究表明，該菌株對(duì)頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，對(duì)四環(huán)素中度敏感，對(duì)苯唑西林、氨芐西林等耐藥。同時(shí)，該菌株檢出Sul2、TEM、ant(3″)-Ⅰa和aac(6′)-Ⅰb等4種耐藥基因。上述研究表明，不同菌株間的藥敏特性及耐藥特征具有一定差異，這些差異可能與菌株所處環(huán)境、宿主來源、抗生素環(huán)境等因素有關(guān)。

抗生素等藥物的廣泛使用可誘導(dǎo)類志賀鄰單胞菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)耐藥基因水平擴(kuò)散或垂直傳播亦可導(dǎo)致該菌耐藥性增強(qiáng)，加大了該菌的防控難度[45]，所以近年來針對(duì)類志賀鄰單胞菌的新防控措施逐漸增多。賴曉健等[38]對(duì)太平洋雙色鰻鱺來源的類志賀鄰單胞菌研究表明，五倍子、丁香和生地榆等中藥提取物對(duì)該菌株具有較好的抑菌效果。李赫等[49]利用16種中草藥提取物對(duì)類志賀鄰單胞菌的體外抑菌研究顯示，丁香對(duì)類志賀鄰單胞菌的抑菌效果最好，其最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為31.25 mg/mL，黃芪次之，其最小抑菌質(zhì)量濃度為62.5 mg/mL。Nisha等[50]從發(fā)酵大米中分離到一株假單胞菌BPH2益生菌，BPH2對(duì)類志賀鄰單胞菌具有很強(qiáng)的抑制作用，該益生菌可有效地應(yīng)用于水、土壤等養(yǎng)殖系統(tǒng)中，控制魚類的細(xì)菌性病害。Gong等[51]從土壤中分離到一株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)SL001，其對(duì)類志賀鄰單胞菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，該菌可提高草魚的免疫力并提高其生長(zhǎng)速度。益生菌資源的挖掘與利用將是今后一段時(shí)期控制水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的重要手段，有利于減緩病原菌的耐藥性變異，提高病原菌的防控效果，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

5 展 望

目前，對(duì)從急性腹瀉、食物中毒的患病人群中分離的類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理的研究相對(duì)較多，但對(duì)從病魚中來源的類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理的研究較少。由于近年來由該菌引起的養(yǎng)殖魚類患病較為頻繁[52]，且對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失，因此有必要對(duì)魚源致病性類志賀鄰單胞菌的分子分型、致病機(jī)理和防控措施等進(jìn)行深入研究，這對(duì)明確該菌對(duì)魚類的致病性并控制其傳播及流行具有重要的意義。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素經(jīng)常被用來控制由細(xì)菌引起的傳染病，但是抗生素的大量使用和長(zhǎng)期反復(fù)使用容易造成細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[53]，還會(huì)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品和環(huán)境造成藥物殘留問題，為此積極開發(fā)早期預(yù)防疫苗、快速診斷試劑盒、非抗生素新型藥物等都具有廣闊前景。此外極有必要開展拮抗菌等新型防治措施研究，分析拮抗菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其對(duì)類志賀鄰單胞菌的抑菌活性，以期找到對(duì)該菌具有較好抑制作用的新型活性物質(zhì)[54]，為傳統(tǒng)魚類抗生素藥物的替代提供研究基礎(chǔ)。