譚春明，趙 旺，吳開暢，溫為庚，楊 蕊，陳 旭，于 剛

( 1.中國水產科學研究院 南海水產研究所，熱帶水產研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018； 2.農業(yè)農村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300 )

方斑東風螺(Babyloniaareolata)屬軟體動物門、腹足綱、蛾螺科，俗稱花螺、海豬螺和南風螺，分布于中國東南地區(qū)、東南亞及日本沿海等，是中國東南沿海主要的經濟貝類。方斑東風螺肉質鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種暢銷且具有推廣前景的優(yōu)質海水養(yǎng)殖貝類[1]。近年來，方斑東風螺的養(yǎng)殖業(yè)在廣東、廣西和海南等沿海地區(qū)發(fā)展較快。但在養(yǎng)殖過程中，常因鹽度波動造成方斑東風螺不攝食、生長慢、不繁殖，影響方斑東風螺的耗氧率和排氨率，甚至出現大量死亡等現象[2-3]。

影響方斑東風螺養(yǎng)殖的關鍵指標是早期發(fā)育階段的攝食行為和活動狀況，而攝食能力又受溫度、水體質量及光照等環(huán)境因子影響[4-5]。鹽度作為水產養(yǎng)殖中重要的水體環(huán)境指標之一，與養(yǎng)殖動物的滲透壓、生長、發(fā)育關系密切[6]。在不同鹽度下，水生動物的生長、成活率、能量代謝酶、非特異性免疫及生化成分均表現出明顯差異[7-8]。海水鹽度直接影響水生生物體內的滲透壓，而滲透壓調節(jié)主要由鰓和皮膚消耗能量從外界環(huán)境主動吸收或排除Na+和Cl-而實現，該能量調節(jié)過程使體內生化成分及免疫、消化相關酶活性發(fā)生改變，影響水生動物的存活、生長、代謝和繁殖[9-10]。劉珊等[11]指出，鹽度的改變會影響水生生物體內血漿滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性，鹽度突變后，各處理組的血液滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性均隨鹽度的變化而上升或下降，其變化幅度與鹽度的變化幅度相關。Chen等[12]在研究不同鹽度條件下中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)幼蝦耗氧量和氨氮排泄量的變化時發(fā)現，鹽度是影響蝦類呼吸代謝的主要因子之一，在最適鹽度時體內外滲透壓處于平衡狀態(tài)，不需要消耗過多能量保持體內的環(huán)境穩(wěn)定。鹽度變化會導致水體無機離子含量發(fā)生變化，影響機體酶活力[13-14]。在水產養(yǎng)殖過程中，適宜的水體鹽度和合理的鹽度調節(jié)模式，不僅能降低水產動物病害暴發(fā)頻率，而且能指導海水動物低鹽度養(yǎng)殖及人工育苗[15]。

目前，鹽度對水產養(yǎng)殖動物的影響研究主要集中在生長發(fā)育方面，包括魚、蝦、蟹及文蛤(Meretrixmeretrix)、九孔鮑(Haliotisdiversicolor)、蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)等動物，而有關鹽度脅迫對貝類機體免疫相關酶活力影響的研究幾乎處于空白。筆者研究方斑東風螺在不同鹽度條件下其體內6種常見免疫酶過氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶活力及行為活動，闡明鹽度對其生理生化的影響及體內免疫酶應對急性脅迫時的調節(jié)規(guī)律，為提高方斑東風螺養(yǎng)殖效益，豐富貝類養(yǎng)殖生態(tài)學理論提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

方斑東風螺60日齡，平均體質量(0.386±0.080) g，殼長(0.65±0.15) cm，由南海水產研究所熱帶水產研究開發(fā)中心(海南，陵水)提供，原地進行試驗。試驗前，方斑東風螺暫養(yǎng)2 d，水質參數：溫度(26.0±1.0) ℃，鹽度33±0.8，溶解氧>6.5 mg/L，pH 8.0±0.2，亞硝態(tài)氮<0.04 mg/L，氨氮<0.01 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

利用海水與淡水或海鹽分別調配成5、10、15、20、25、30、35、40、45和50共10個鹽度梯度的養(yǎng)殖用水，放入健康狀況良好、大小均一的方斑東風螺，觀察其攝食行為、活動及存活狀況，計算24、96 h 100%死亡質量濃度(24 h LC100和96 h LC100)，并以此設置各試驗組的鹽度。

設置18、23、28、33(對照組)、38共5個試驗鹽度，每個鹽度設3個平行，每個試驗容器(4 L，方形，藍色，溶解氧6.8～7.0 mg/L)內投放30只健康良好的方斑東風螺，分別于6、12、24、36、48、72、96 h自各養(yǎng)殖桶中隨機取樣3只測定其免疫酶活力。每隔3 h自每個容器中取水樣100 mL，嚴格控制各水質指標在設定范圍內，及時調整發(fā)生變化的指標。日換水2次，每次換水50%，每24 h投喂一定量冰鮮魚，除去養(yǎng)殖桶中的排泄物、剩余餌料及死去的方斑東風螺。間隔觀察并記錄各試驗組方斑東風螺的攝食、活動狀況、中毒癥狀以及死亡率。方斑東風螺置于塑料板上無明顯活動跡象，用解剖刀觸碰無反應即判斷為死亡。

1.2.2 樣品處理

用0.2 mol/L生理鹽水將各試驗組樣品按1∶2(m/V)比例研磨。研磨液于5000 r/min、4 ℃下離心10 min，取1 mL上清液于潔凈EP管中，置于冰箱-80 ℃保存待測。總蛋白含量及各酶活性用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.2.3 數據處理與分析

數據采用平均值±標準差表示，用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。先對數據作單因素方差分析，若處理間有顯著差異，再用Duncan法比較均值間的差異顯著性(P<0.05)。為更好地呈現酶活的變化(誘導或抑制)，以處理組與對照組酶活性的百分比為數據作圖，二者活性相等時定義為100%。

2 結 果

2.1 鹽度脅迫對方斑東風螺行為及存活的影響

隨著鹽度在自然海水基礎上的升高或降低，各鹽度組方斑東風螺呈不同應激行為甚至死亡，主要表現為不活躍、運動緩慢，對外界刺激反應遲鈍，爬壁運動減少，逐漸翻背，沉于水桶底部，身體僵硬直至死亡。死亡的方斑東風螺吻管向外凸出，螺肉外翻、慘白僵硬。鹽度5、10、50處理組24 h內方斑東風螺便全部死亡，而鹽度40組雖然100%存活但不活躍，運動遲緩，不爬壁，鹽度15、20、25組有翻背現象，鹽度30和35組基本良好，但長時間應激下呈現不活躍狀況(表1)。由此可見，96 h的脅迫下方斑東風螺生長發(fā)育能適應的鹽度范圍較寬，但鹽度低于15或高于40便出現超高死亡率。

表1 鹽度脅迫對方斑東風螺行為及存活率的影響

2.2 鹽度脅迫對方斑東風螺過氧化氫酶活性的影響

鹽度脅迫時間對方斑東風螺的過氧化氫酶活性影響極顯著(P<0.01)，不同鹽度脅迫各組間個體過氧化氫酶活性變化同樣存在顯著差異(P<0.05)(圖1)。低鹽度處理6 h時方斑東風螺個體過氧化氫酶活性顯著低于對照組，而高鹽度組個體過氧化氫酶活性上升；隨著鹽度處理時間的延長，鹽度18、23組方斑東風螺表現為“抑制—誘導”的變化趨勢，而鹽度28和38組卻呈現“誘導—抑制—誘導”的趨勢。

圖1 鹽度對方斑東風螺過氧化氫酶活性的影響

2.3 鹽度脅迫對方斑東風螺酸性磷酸酶活性的影響

脅迫時間和不同鹽度均顯著影響方斑東風螺酸性磷酸酶活性(P<0.05)(圖2)。鹽度為18、38時，方斑東風螺酸性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，之后，隨著處理時間不斷增加，酸性磷酸酶活性呈現抑制趨勢。鹽度為23、28組個體酸性磷酸酶活性在輕微抑制之后隨時間顯著提高(P<0.05)，最終表現為酸性磷酸酶活性受抑制?？梢?，鹽度脅迫對方斑東風螺酸性磷酸酶活性的影響總體呈“誘導—抑制”的變化趨勢。

圖2 鹽度對方斑東風螺酸性磷酸酶活性的影響

2.4 鹽度脅迫對方斑東風螺堿性磷酸酶活性的影響

鹽度脅迫對方斑東風螺堿性磷酸酶活性的影響見圖3。處理組個體堿性磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性的變化趨勢幾乎一致。不同鹽度和處理時間對方斑東風螺處理組個體堿性磷酸酶活性影響顯著(P<0.05)，鹽度為18、38時，處理組方斑東風螺個體堿性磷酸酶的活性顯著上升(P<0.05)，之后，隨著處理時間不斷增加，堿性磷酸酶活性呈現抑制趨勢。鹽度為23、28組堿性磷酸酶活性在輕微抑制之后隨時間變化顯著提高(P<0.05)，但最終表現為堿性磷酸酶活性受抑制。鹽度脅迫對方斑東風螺個體堿性磷酸酶活性的影響總體表現出“誘導—抑制”的變化趨勢。

圖3 鹽度對方斑東風螺堿性磷酸酶活性的影響

2.5 鹽度脅迫對方斑東風螺總超氧化物歧化酶活性的影響

鹽度脅迫對方斑東風螺總超氧化物歧化酶活性的影響見圖4。處理時間對方斑東風螺總超氧化物歧化酶活性影響極顯著(P<0.01)，不同鹽度組個體總超氧化物歧化酶活性變化在短時間內不存在明顯差異(P>0.05)。與對照組相比，高鹽度處理組(38)對總超氧化物歧化酶活性的影響表現為“誘導—抑制—誘導”，而其他鹽度組(18、23、28)隨時間的變化均表現為“誘導—抑制”的趨勢。雖然96 h時，處理組總超氧化物歧化酶活性有回升的趨勢，但仍然無法回到正常鹽度下的狀態(tài)。

圖4 鹽度對方斑東風螺總超氧化物歧化酶活性的影響

2.6 鹽度脅迫對方斑東風螺谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

鹽度脅迫對方斑東風螺谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響見圖5，鹽度脅迫時間對方斑東風螺谷胱甘肽過氧化物酶活性影響極顯著(P<0.01)，不同鹽度脅迫對各組個體谷胱甘肽過氧化物酶活性變化趨勢存在明顯差異(P<0.05)。相比對照組，各鹽度組方斑東風螺個體谷胱甘肽過氧化物酶活性均呈“抑制—誘導—抑制”的變化趨勢，其中鹽度28組個體谷胱甘肽過氧化物酶活性的峰值出現在12 h，其他各鹽度個體谷胱甘肽過氧化物酶活性的峰值均在24 h。試驗終止時，各處理組谷胱甘肽過氧化物酶活性均低于對照組，表現為抑制作用。

圖5 鹽度對方斑東風螺谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

2.7 鹽度脅迫對方斑東風螺過氧化物酶活性的影響

各處理時間對方斑東風螺過氧化物酶活性影響極顯著(P<0.01)，不同鹽度脅迫對各組個體過氧化物酶活性變化趨勢存在顯著差異(P<0.05)(圖6)。相比對照組，鹽度23、28處理組個體過氧化物酶活性先誘導后抑制；而鹽度18、38組在24 h過氧化物酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，隨時間的變化呈現“抑制—誘導—抑制”的變化趨勢。試驗終止時，除鹽度28組略微上升外，其他各脅迫組個體過氧化物酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖6 鹽度對方斑東風螺過氧化物酶活性的影響

3 討 論

3.1 鹽度對方斑東風螺個體存活和活力的影響

本試驗中，在鹽度脅迫下方斑東風螺表現出一定的應激行為即中毒現象。耐鹽性及存活率結果表明，方斑東風螺具有較強的抗逆性，但養(yǎng)殖用水鹽度低于15或高于45便會出現超高死亡率。楊章武等[3]在研究鹽度對方斑東風螺攝食與生長的影響時指出，方斑東風螺適宜鹽度為21～33，下限為15，在非適宜鹽度下方斑東風螺的攝食率和生長速度明顯減低。這一耐受性還與方斑東風螺所處的發(fā)育階段有關，稚螺期的鹽度耐受性較胚胎期強。方斑東風螺胚胎發(fā)育時期的最適鹽度為20～28，最低和最高臨界鹽度為14和32[16]。在養(yǎng)殖過程中應根據生長期盡可能控制養(yǎng)殖水體處在適宜的鹽度范圍。

3.2 鹽度對方斑東風螺個體免疫酶活性的影響

研究表明，當海洋魚貝類處在不適宜的鹽度環(huán)境下時，其抵抗力、免疫力、食物消化吸收率和代謝率等會降低, 進而對生物體的生長和存活造成嚴重威脅，而貝類免疫力的下降甚至造成病害暴發(fā)[17-20]。鹽度對魚貝類等水生動物的影響主要和滲透壓調節(jié)有關，而滲透壓主要通過影響細胞膜的通透性[21]、激素的調節(jié)[22]、蛋白的表達[23]和離子通道表達[24]來改變個體生理功能，影響個體的生長發(fā)育。不少研究指出，滲透壓影響水生動物的生化成分(蛋白質、脂肪酸、氨基酸等)、消化酶及免疫酶活性，進而影響其消化系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)[7,10,25-27]。水生動物的免疫系統(tǒng)在應對不良環(huán)境的刺激時起主導作用，其中過氧化氫酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶以及谷胱甘肽過氧化物酶等在免疫調節(jié)過程中占重要地位[28-29]。本試驗測定了鹽度脅迫下方斑東風螺6種免疫酶的活性，結果表明，無論是脅迫時間還是脅迫劑量均顯著影響免疫酶活性。與對照組相比，隨著處理時間的變化，總體上過氧化氫酶活性表現出“誘導—抑制—誘導”的變化趨勢，而谷胱甘肽過氧化物酶活性表現為“抑制—誘導—抑制”的變化趨勢。這與鹽度對條石鯛(Oplegnathusfasciatus)幼魚[30]肝臟抗氧化酶活力的影響規(guī)律相一致，隨著鹽度升至38，總體上過氧化氫酶活性表現出“誘導—抑制—誘導”的趨勢?？寡趸富钚缘奶岣呖赡苁秦愵愒邴}度脅迫環(huán)境下，活性氧自由基大量產生，機體處于過氧化狀態(tài)，為保持抗氧化系統(tǒng)處在動態(tài)平衡而作出的一種反應。但是，當機體產生的活性氧量超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，便會氧化損傷細胞結構，使抗氧化酶活性降低。另外，在非等滲環(huán)境中，需要消耗體內儲存的能量來適應水體的鹽度變化，該過程會導致機體消化酶及免疫酶活力發(fā)生變化[30-31]。本試驗結果表明，方斑東風螺不同處理組的各免疫酶活性均隨鹽度的增加或時間的延長呈先升后降的變化趨勢；低鹽度對消化酶活力的影響大于高鹽度。然而，方斑東風螺酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性隨著脅迫時間的變化呈現出先誘導后抑制。這也支持了其他水生生物的研究結果。如陳宇鋒等[32]發(fā)現鋸緣青蟹(Scyllaserrata)超氧化物歧化酶活性隨著鹽度的增加先促進后抑制；宋曉楠等[33]在研究鹽度變化對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)體內抗氧化酶活力的影響時指出，在鹽度25和鹽度15脅迫下其體內超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性呈現“先顯著升高后顯著下降”的變化趨勢；徐立紅等[34]指出，受到輕度逆境脅迫時，誘導魚體堿性磷酸酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等活性，而受重度逆境脅迫時，其活性則被抑制。這種現象可能是細胞代謝發(fā)生一定程度的改變所引起的而不是免疫應激的結果，生物體長時間在高鹽度脅迫下，免疫體系不能及時清除其體內自由基，破壞了機體的氧化與抗氧化平衡，致使自由基在魚體內累積，從而對細胞產生氧化損傷[34-35]。在一定程度上，免疫酶活性恢復正常水平的時間反映了機體對環(huán)境的適應能力。

各免疫酶活性隨著鹽度的變化雖然具有顯著性，但并不存在明顯的線性關系或一致規(guī)律，變化規(guī)律較特異，這可能與方斑東風螺的高抗逆性等生理習性或所處發(fā)育階段不同有關，也可能是鹽度脅迫對其免疫系統(tǒng)造成了一定紊亂效應，但脅迫處理劑量仍在其適應范圍內。另外，試驗對象規(guī)格不同、養(yǎng)殖密度不同以及溶解氧、餌料量等環(huán)境因子不同，同樣可造成鹽度脅迫程度的顯著差異。

4 結 論

研究表明，方斑東風螺生長發(fā)育狀態(tài)良好的鹽度為20～35，當養(yǎng)殖用水鹽度低于15或高于40便出現超高死亡率；相同高、低鹽度條件下，脅迫時間越長，方斑東風螺死亡率也越高。不同鹽度和處理時間均顯著影響方斑東風螺免疫酶活力(P<0.05)，受到輕度逆境脅迫時，誘導方斑東風螺過氧化氫酶、堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，而受重度逆境脅迫時，則抑制其活性。本試驗警示，方斑東風螺及其他水生動物養(yǎng)殖過程中，應嚴格控制好水體中的鹽度以防應激反應，以提高方斑東風螺養(yǎng)殖的存活率和促進其生長發(fā)育。