蔡 冰，陳萬光，王 凡，左小玉

( 洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934 )

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)為鮭科的冷水性代表魚類，因其肉質(zhì)鮮美而受到廣大消費者的青睞，使其成為目前養(yǎng)殖最廣泛的淡水魚類之一[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖密度、飼料用量和水環(huán)境質(zhì)量等原因?qū)е潞琪V病害頻發(fā)?；【?Vibrio)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的致病菌，具有流傳廣和發(fā)病率高等特點，而弧菌病對虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展影響巨大[2]。

目前，對病原微生物的防控多使用抗生素和化學合成藥物，但這些藥物長期不合理的應用會使病原菌產(chǎn)生耐藥性并導致水產(chǎn)品中藥物殘留量超標，造成環(huán)境的污染并最終威脅人類健康[3-4]。中草藥作為天然藥物，歷史悠久，富含各種活性物質(zhì)以及微量元素，具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢[5]。因此，中草藥在魚類養(yǎng)殖上的應用不僅能夠預防治療疾病，還能夠保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。復方中草藥能夠有效結(jié)合各種不同的單一中草藥藥效，從而使預防和治療發(fā)揮到最大效果[6]。研究表明，復方中草藥添加劑能夠增強水產(chǎn)動物的免疫力和抗病力[4-5,7-11]。

紅棗、山藥和黃芪是我國常見食用兼藥用的中藥藥材。研究表明，大棗提取液對細胞及體液免疫均具有很強的促進效果，可增強免疫功能[12]；山藥提取物能夠調(diào)控虹鱒免疫系統(tǒng)中的趨化因子信號途徑、白細胞經(jīng)內(nèi)皮細胞遷移通路和血小板活化通路[13]；黃芪提取物對鯉魚(Cyprinuscarpio)肝臟損傷具有一定的保護作用且對常見病原菌具有很強的抑菌效果[14-15]。

副溶血弧菌(V.parahemolyticus)容易引起細菌性食物中毒，主要分布于沿岸海水和水產(chǎn)品中，近年來，其在淡水魚體內(nèi)和養(yǎng)殖水體中被廣泛地檢測出[16]。筆者對投喂復方中草藥添加劑(紅棗提取物+山藥提取物+黃芪提取物)的虹鱒在副溶血弧菌感染下的抗氧化基因的表達影響進行探索，以期解釋復方中草藥對虹鱒在病原菌刺激下的抗氧化免疫反應的分子機制，并為在虹鱒養(yǎng)殖中的復方中草藥添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

虹鱒幼魚購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體長7.6～8.9 cm，于洛陽師范學院冷水魚養(yǎng)殖工程研究中心循環(huán)系統(tǒng)的圓柱形水族箱(直徑1 m)中暫養(yǎng)14 d；每日定時投喂虹鱒幼體基礎飼料2次；暫養(yǎng)期間，水溫11～15 ℃，pH 7.0±0.2，溶解氧>8.0 mg/L。取規(guī)格一致、游動敏捷和健康良好的虹鱒幼體分組進行試驗。

1.2 試驗試劑

紅棗提取物(20∶1型)、黃芪提取物(20∶1型)和山藥提取物(20∶1型)(陜西森弗天然制品有限公司)，副溶血弧菌(中國微生物菌種保藏中心)，總RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)，Gold View Ⅰ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)，Bestar qPCR Mastermix(德國DBI公司)，基因引物(華大基因公司)。

1.3 試驗飼料的制備

根據(jù)肉食性魚類的營養(yǎng)需求并參考相關虹鱒基礎飼料配方[17]，設計本試驗虹鱒基礎飼料的配方：膨化豆粕35%、魚粉40%、糊化淀粉14.7%、魚油4%、大豆油4%、氯化膽堿0.3%、磷酸二氫鈣1%和預混料1%。先將20∶1的紅棗、黃芪和山藥提取物按照1∶1∶1比例配合成復合物，然后以質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.6%和1.2%添加到基礎飼料中制成復合中草藥飼料，以復方中草藥零添加的基礎飼料為對照組?；A飼料及各添加劑組的飼料配方見表1。

表1 虹鱒飼料配方 %

1.4 試驗飼料的投喂

試驗設計分為對照組和3個添加組，其中對照組投喂基礎飼料組(即復合中草藥提取物添加量為0)，試驗添加組分別投喂含復合中草藥提取物0.3%、0.6%和1.2%的基礎飼料。每組隨機挑選暫養(yǎng)后的虹鱒幼魚30尾進行投喂試驗，其他條件同暫養(yǎng)期間。

1.5 細菌攻毒試驗與取樣

飼料投喂56 d后，隨機選取各組的虹鱒幼魚10尾，每尾注射0.2 mL副溶血弧菌(2.74×107cfu/mL)進行攻毒試驗；弧菌攻毒4 d后，對虹鱒幼魚進行解剖，每組取出6尾虹鱒幼魚的中腸組織，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰箱中-80 ℃低溫保存，用于后期抗氧化相關基因表達的檢測。

1.6 抗氧化相關基因表達的檢測

1.6.1 引物序列

內(nèi)參基因EF-1 Alpha以及目的基因GST、HSP90BB、CAT、GPx1和SOD基因的引物序列來源于參考文獻[18](表2)。

表2 PCR所用基因的特異性引物及其序列

1.6.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

按照總RNA極速抽提試劑盒提供的方法，提取每尾虹鱒幼體的中腸組織樣品，并對RNA進行質(zhì)量分析。對質(zhì)量好、含量適宜和純度高的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄反應。

1.6.3 半定量PCR

半定量PCR是對各目的基因在對照組和添加劑組的虹鱒中腸的表達量是否存在差異的定性分析。為鑒定引物特異性是否符合半定量試驗的要求，在進行正式半定量反應之前，用普通PCR來分析引物的特異性。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA加入特異性良好的目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、2×Tap MasterMix及無菌水制備成25 μL反應體系。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳觀察并保存各基因表達結(jié)果。

1.6.4 實時熒光定量PCR

為了驗證半定量PCR的定性分析結(jié)果，并對各目的基因在對照組和添加劑組的虹鱒中腸中的表達量進行定量分析，進行實時熒光定量PCR試驗。為鑒定引物特異性是否符合實時熒光定量試驗的要求，在進行正式實時熒光定量反應之前，用實時熒光定量PCR儀來分析引物的特異性。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA加入特異性良好的目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、Bestar qPCR Mastermix及無菌水制備成20 μL反應體系。PCR反應條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃ 86個循環(huán)。

1.6.5 數(shù)據(jù)分析

使用 SPSS 13.0軟件，對實時熒光定量PCR的結(jié)果進行單因素方差分析，并用LSD方法比較復方中草藥添加劑組與對照組之間的差異顯著性(P<0.05差異顯著；P<0.01差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量和含量、內(nèi)參基因及目的基因特異性和有效性的檢測

提取的RNA 光密度(OD)值在1.8～2.0，通過凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)28S∶18S約為2∶1。RNA的質(zhì)量濃度為168.61～551.06 ng/μL。試驗結(jié)果表明，RNA的質(zhì)量和質(zhì)量濃度整體符合反轉(zhuǎn)錄的要求。

瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明，目的基因和內(nèi)參基因引物電泳條帶單一明亮，且不拖尾(圖1)。實時熒光定量PCR對各基因的熔解曲線顯示，熔解峰單一(圖2)。試驗結(jié)果表明，EF-1 Alpha、GST、HSP90BB、CAT、GPx1和SOD基因的引物特異性良好，符合半定量PCR和實時熒光定量PCR試驗的要求。

圖1 虹鱒腸中內(nèi)參EF-1 Alpha及目的基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖2 內(nèi)參EF-1 Alpha及目的基因的熔解曲線檢測

2.2 弧菌對添加中草藥飼料后的虹鱒腸道抗氧化相關基因表達定性分析

半定量PCR結(jié)果見圖3，通過分析添加各質(zhì)量分數(shù)的復方中草藥添加組的抗氧化基因(GST、HSP90BB、GPx1、CAT)和內(nèi)參基因(EF-1 Alpha)的表達水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GST與CAT基因的表達水平在0.3%和0.6%添加組有上調(diào)趨勢；HSP90BB基因的表達水平在0.3%和1.2%添加組有上調(diào)趨勢；GPx1基因的表達水平在0.3%添加組有上調(diào)趨勢；SOD基因的表達水平在0.3%、0.6%和1.2%添加組均出現(xiàn)明顯下調(diào)。

圖3 不同添加組虹鱒腸道抗氧化基因的定性表達情況

2.3 弧菌對添加中草藥飼料后抗氧化相關基因表達定量分析

與對照組相比，GST和CAT基因相對表達量在0.3%和0.6%添加組均出現(xiàn)顯著上升趨勢(圖4)，其中GST基因相對表達量分別上調(diào)30.5%和45.6%，CAT基因相對表達量分別上調(diào)302.10%和162.55%，而1.2%添加組與對照組相比差異不顯著；HSP90BB基因相對表達量在0.3%和1.2%添加組出現(xiàn)顯著上升趨勢，分別上調(diào)214.74%和60.75%，而0.6%添加組與對照組相比無顯著差異；GPx1基因相對表達量在0.3%添加組出現(xiàn)顯著上升趨勢，上調(diào)達107.55%，而0.6%和1.2%添加組與對照組相比差異不顯著；SOD基因相對表達量在0.3%和0.6%添加組卻出現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢，分別下調(diào)47.7%和59.6%，1.2%添加組與對照組相比差異不顯著。

圖4 不同質(zhì)量分數(shù)添加劑組虹鱒中腸基因mRNA的表達

3 討 論

動物體內(nèi)抗氧化能力是機體非特異性免疫的重要組成部分，與多種疾病的發(fā)生密切相關[5]?？寡趸负蜔釕さ鞍讓儆谥匾姆翘禺愋悦庖咧笜??；虮磉_水平一般是通過該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少來衡量的，編碼應激相關蛋白和抗氧化酶基因的差異轉(zhuǎn)錄水平已被用于檢測外來物質(zhì)的生物學效應[19-20]。腸道是魚類最大的免疫器官，中腸又稱主腸，因此，筆者對投喂復方中草藥添加劑(紅棗提取物+山藥提取物+黃芪提取物)的虹鱒在副溶血弧菌感染下的抗氧化基因mRNA影響進行探索。

3.1 復方中草藥對虹鱒在副溶血弧菌感染下的抗氧化酶mRNA影響

活性氧是有機體內(nèi)最常見的自由基，而機體抗氧化系統(tǒng)作為一種完整而復雜的自由基清除系統(tǒng)，能夠保護自身免受氧化損傷[5,8]。SOD基因表達產(chǎn)物為超氧化物歧化酶，是機體清除自由基的重要抗氧化酶，能夠催化超氧化物陰離子自由基并且歧化為過氧化氫與氧氣，保護細胞免受氧自由基氧化損傷[5,8,11]。CAT基因表達產(chǎn)物為過氧化氫酶，該酶是動植物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，主要作用是將過氧化氫催化分解為水和氧氣，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒性產(chǎn)物[8]。谷胱甘肽系統(tǒng)是生物體內(nèi)的重要抗氧化系統(tǒng)，在機體非特異性免疫過程中發(fā)揮重要作用[21-22]。GPx基因表達產(chǎn)物為谷胱甘肽過氧化物酶，通過還原性谷胱甘肽催化還原過氧化物和有機過氧化物，從而保護細胞和其他如DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)體等敏感生物分子免受氧自由基損傷[5]。GPx1是GPx家族成員之一，能清除過氧化氫和脂肪酸過氧化氫[23]。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST基因表達產(chǎn)物)是生物體內(nèi)重要的解毒酶，可以清除細胞內(nèi)因宿主的免疫效應而產(chǎn)生的自由基和過氧化物等產(chǎn)物[24]。

3.2 復方中草藥對虹鱒在副溶血弧菌感染下的熱應激蛋白mRNA影響

HSPs基因表達產(chǎn)物是熱應激蛋白，是一類在應激狀態(tài)下幫助其他蛋白正確折疊的一類進化上高度保守的蛋白家族[29-30]。其中HSP90BB是HSPs家族的重要成員之一，可通過抑制氧自由基的關鍵酶產(chǎn)生來減少氧自由基的產(chǎn)生，尤其是在免疫反應時HSP90基因表達更為強烈[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，投喂添加復方中草藥飼料的虹鱒幼體在感染副溶血弧菌4 d后，0.3%和1.2%添加組HSP90基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，進而可能致使HSP90蛋白水平提高。這表明，投喂0.3%和1.2%復方中草藥的虹鱒幼體可能通過提高HSP90蛋白水平來抑制自由基的關鍵酶產(chǎn)生，進而減少氧自由基的產(chǎn)生，從而增強虹鱒抗氧化能力。這與林天勢等[32]的研究病原菌感染大黃魚(Larimichthyscrocea)后熱應激蛋白表達水平的結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

投喂復方中草藥飼料添加劑(紅棗+山藥+黃芪)后的虹鱒在受到副溶血弧菌感染時，CAT、GPx1、GST和HSP90BB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，從而可能致使抗氧化相關能力提高，其中0.3%添加組的效果較好。這一結(jié)果有助于復方中草藥添加劑的飼料在虹鱒水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中進行推廣應用。