何海棟，柴秀娟，徐衛(wèi)華，周穎，許先榮

（浙江省立同德醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 杭州 310012）

2019年浙江省癌癥中心發(fā)布《2015年浙江省腫瘤登記地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病與死亡分析》[1]，結(jié)果顯示肺癌的發(fā)病率和致死率均居榜首，是浙江省腫瘤防治的重中之重。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占所有原發(fā)性肺癌的80%～85%，發(fā)病患者多為老年人，確診時大多已處于中晚期，且腫瘤的轉(zhuǎn)移率、復發(fā)率高[2-3]。免疫檢查點靶向治療NSCLC 是當前的研究熱點，療效顯著，能延長患者生存期[4-6]。PD-L1 是PD-1 最主要的配體之一，主要表達于免疫淋巴細胞、惡性腫瘤細胞、巨噬細胞等[7-8]。 細胞核相關(guān)抗原Ki67 是一種與細胞增殖相關(guān)的蛋白，除G0期外，在整個細胞周期中均有表達，可用于反映腫瘤細胞所處周期和增殖狀態(tài)，與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及預后關(guān)系密切[9]。當前，NSCLC 的靶向治療通常以PD-L1、Ki67、CTLA-4 等靶點為主[10-12]。本研究通過檢測浙江省立同德醫(yī)院收治的90 例NSCLC 患者病理組織標本中PD-L1 和Ki67 的表達，探討PD-L1、Ki67 與NSCLC 患者臨床病理特征及預后的關(guān)系，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年11月—2018年11月浙江省立同德醫(yī)院收治的90 例NSCLC 患者。收集其臨床資料，包括年齡、性別、病理分型、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等。其中，男性54例，女性36例；年齡26 ～83 歲，平均（60.67±10.87）歲；臨床分期： Ⅰ期15 例，Ⅱ期19 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期24 例。納入標準： 符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》[13]NSCLC 的診斷標準。排除標準： 術(shù)前接受過放化療；有免疫系統(tǒng)疾病；正在接受免疫相關(guān)治療的患者；臨床資料、個人信息不全者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬均知情同意并簽署知情同 意書。

1.2 研究方法

1.2.1 HE 染色HE 染色觀察肺組織病變。所有手術(shù)切除標本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片（厚約4μm）、脫蠟水化。蘇木精染色8 min，自來水沖洗至返藍后鹽酸酒精分化，伊紅染色1 min、放入TO 型生物制片透明劑中10 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學法免疫組織化學SP 法檢測肺癌組織中PD-L1 和Ki67 的表達。相關(guān)操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，切片3% H2O2修復后加入一抗兔抗人PD-L1 和鼠抗人Ki67，37℃孵育30 min。PBS 沖洗3 次，加入二抗，37℃孵育30 min，DAB 顯色。設(shè)已知陽性片和陰性對照，HE 染色作組織學對照。單克隆抗體購自德國默克公司。免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

1.2.3 結(jié)果判定由≥2 位病理醫(yī)師進行結(jié)果判定。陽性細胞數(shù)≥5%為PD-L1 或Ki67 陽性，無染色或陽性細胞數(shù)＜5%為PD-L1 或Ki67 陰性。陽性細胞≤ 25%為低表達，陽性細胞數(shù)＞25%為高表達。

1.2.4 隨訪隨訪時間截至2019年11月30日。通過電話、信函和查閱醫(yī)院病案記錄等方式隨訪。所有患者具有完整隨訪資料。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 患者肺組織中PD-L1、Ki67 的表達

HE 染色結(jié)果顯示，NSCLC 患者肺組織中細胞較小，細胞核深染，細胞核質(zhì)比增加，細胞呈彌散狀排列（圖1A）。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，PD-L1 主要表達于細胞膜（圖1B），Ki67 主要表達于細胞核 （圖1C）。90 例NSCLC 患者中，PD-L1 陽性62 例（68.89%）， 陰性28 例（31.11%）；Ki67 陽性58 例（64.44%），陰性32 例（35.56%）。

圖1 NSCLC 患者肺組織HE 和免疫組織化學染色

2.2 PD-L1、Ki67 與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系

不同病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PD-L1 陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。鱗癌、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PD-L1 陽性率較高。不同性別、病理分型、腫瘤分化程度患者的Ki67 陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。女性、鱗癌、低分化患者Ki67 陽性率較高。見表1。

2.3 NSCLC 患者PD-L1、Ki67 高表達的影響因素

分析PD-L1 高表達的影響因素時，以PD-L1 為因變量，病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為自變量，進行多因素Logistic 回歸分析；分析Ki67 高表達的影響因素時，以Ki67 為因變量，性別、病理分型、腫瘤分化程度為自變量，進行多因素Logistic 回歸分析。鱗癌、腺癌及其他病理分型分別賦值為0、1、2；低、中、高分化分別賦值為0、1、2；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別賦值為0 和1；男性和女性分別賦值為0 和1。結(jié)果顯示，病理分型[=2.716（95% CI： 1.695，3.375）]、腫瘤分化程度[=3.655（95% CI： 1.737，8.096）]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=3.054（95% CI： 1.542，4.116）]是PD-L1 高表達的影響因素；性別[=2.857（95% CI： 1.609，4.641）]、病理分型[=6.171（95% CI： 1.613，9.675）]、腫瘤分化程度[=2.282（95% CI： 1.704，2.957）]是Ki67 高表達的影響因素。見表2。

2.4 PD-L1、Ki67 與NSCLC 患者預后的關(guān)系

90 例NSCLC 患者中，失訪6 例，死亡38 例。PD-L1 陽性患者2年生存率（48.39%）低于PD-L1陰 性 患 者（78.57%）（χ2=7.204，P=0.007）。其 中PD-L1 陽性患者的中位生存時間為42 周，PD-L1 陰性患者為65 周，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.672，P=0.011）。Ki67 陽性患者2年生存率（48.27%）低于Ki67 陰性患者（75.00%）（χ2=6.037，P=0.014）。其中Ki67 陽性患者的中位生存時間為41 周，Ki67 陰 性 患 者 為66 周，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.504，P=0.008）。見 圖2、3。

表1 不同臨床病理特征患者的PD-L1、Ki67 陽性率比較 例（%）

表2 NSCLC 患者PD-L1、Ki67 高表達的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

圖2 PD-L1 陽性與陰性患者的生存曲線

圖3 Ki67 陽性與陰性患者的生存曲線

3 討論

NSCLC 是原發(fā)性肺癌的主要類型，約75%患者在發(fā)病時已處于中晚期，大多已錯過最佳手術(shù)時機[14]。 不同人種、地區(qū)、民族之間存在基因的差異性表達。如東亞人和西方人在某些基因的表達上存在差異[15]。PD-L1 是一種跨膜糖蛋白，在病理狀態(tài)下通過與其受體PD-1 結(jié)合，抑制免疫T 淋巴細胞的活化和增殖，參與腫瘤免疫逃逸，促進惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。Ki67 是一種細胞增殖標志物，屬于非組蛋白，對蛋白酶敏感性極高，其水平變化會引起信號轉(zhuǎn)導異常，從而參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[17]。

本研究納入的NSCLC 患者肺癌組織中細胞較小，細胞核深染，細胞核質(zhì)比增加，細胞呈彌散狀排列。PD-L1 主要表達于細胞膜，陽性表達率為68.89%。Ki67 主要表達于細胞核，陽性表達率為64.44%。與其他研究結(jié)果大致相似[18-19]。以上結(jié)果表明，NSCLC患者肺癌組織中存在PD-L1 和Ki67 高表達。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PD-L1 高表達的影響因素。鱗癌患者PD-L1 陽性率高于腺癌和其他分型患者，與吳鴻念等[20]的研究結(jié)果一致。低分化患者PD-L1 陽性率高于高、中分化患者；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PD-L1陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，這可能與PD-L1 抑制CD4+和CD8+T 細胞的活化和增殖有關(guān)[21]。此外，NSCLC 患者的性別、病理分型、腫瘤分化程度是Ki67 高表達的影響因素。男性患者Ki67 陽性率高于女性；低分化患者Ki67 陽性率高于高、中分化患者，說明Ki67 可能與雌激素的分泌、細胞增殖活躍程度有關(guān)[22]。鱗癌患者Ki67 陽性率高于腺癌和其他分型患者，與單彬彬等[23]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，PD-L1 陽性患者2年生存率（48.39%）低于PD-L1 陰性患者，PD-L1 陽性患者的中位生存時間為42 周，低于PD-L1 陰性患者的65 周，說明PD-L1 的表達與患者預后有關(guān)。Ki67 陽性患者2年生存率（48.27%）低于Ki67 陰性患者，Ki67 陽性患者的中位生存時間為41 周，低于Ki67 陰性患者的66 周，說明Ki67 的表達與患者預后有關(guān)。PD-L1、Ki67 對NSCLC 患者生存率和生存期的估計具有一定指導意義。

綜上所述，NSCLC 患者肺癌組織中存在PD-L1和Ki67 高表達。NSCLC 患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PD-L1 高表達有關(guān)；NSCLC 患者的性別、病理分型、腫瘤分化程度與Ki67 高表達有關(guān)。PD-L1、Ki67 陽性患者預后較差。