王立成，李現(xiàn)鐸，陳冬冬，唐冠寶，門(mén)同義

（山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院 泌尿外二科，山東 濟(jì)南 250014）

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病終末期的共同病變過(guò)程。因腎小管上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，正常的腎臟結(jié)構(gòu)被細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）替代。KLF-4 抑制多種細(xì)胞上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)控腎纖維化發(fā)展進(jìn)程[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA（miRNA）是纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞生物學(xué)功能的主要調(diào)控者[6-8]。本研究旨在分析miR-381 與KLF-4 在腎纖維化發(fā)展進(jìn)程中的調(diào)控關(guān)系，為診斷及治療腎纖維化提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月—2017年12月山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院收治的106 例腎纖維化患者。其中，男性59 例，女性47 例；平均年齡（53.42±12.15）歲。所有患者無(wú)泌尿系感染、糖尿病及惡性腫瘤。收集同期本院健康體檢者100 例作為對(duì)照組。其中，男性50 例，女性50 例；平均年齡（52.35±10.33）歲。

1.2 外周血采集

采用美國(guó)BD 公司一次性血清分離膠管，所有納入患者及健康體檢者于清晨空腹?fàn)顩r下抽取外周靜脈血約3 ml，靜置。待血清析出后，使用臺(tái)式離心機(jī)以1 500 r/min 離心10 min，取上層血清，凍存至-80℃冰箱待檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

采用美國(guó)Invitrogen 公司Trizol 試劑盒提取總RNA，將提取到的總RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應(yīng)用美國(guó)ABI 公司StepOne Plus 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀，嚴(yán)格按照日本TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq PCR 反應(yīng)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

NRK49F 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，在10%磷酸鹽緩沖液（PBS）的DMEM-LG 培養(yǎng)基中，37℃、95%空氣、5%二氧化碳的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋率達(dá)85%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代過(guò)程中，棄去原DMEM-LG 培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS 洗3 次，再用0.25%胰酶消化1 min。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化過(guò)程，待細(xì)胞變圓、邊緣變亮后，加入含10% PBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化并將細(xì)胞按照1∶3 的比例進(jìn)行傳代。將細(xì)胞分為miR-381 組、NC 組、Ang Ⅱ組、空白組。miR-381 組按照說(shuō)明書(shū)將miR-381mimics 轉(zhuǎn)染進(jìn)NRK49F 細(xì)胞；NC組按照說(shuō)明書(shū)將negative control miRNA mimics 轉(zhuǎn)染進(jìn)NRK49F細(xì)胞；AngⅡ組將AngⅡ作用于NRK49F細(xì)胞；空白組未做任何處理。

1.5 熒光素酶報(bào)告分析

構(gòu)建KLF-4 野生型3’-UTR 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-WT，并以pMIR-WT 質(zhì)粒為模板，利用PCR 搭橋法構(gòu)建其潛在結(jié)合位點(diǎn)突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-MUT。用pMIR-WT 或pMIR-MUT 分別轉(zhuǎn)染miR-381 組和NC 組NRK49F 細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后，用Passive lysis buffer 裂解細(xì)胞后分析雙熒光素酶活性。

1.6 Western blotting

棄去培養(yǎng)皿中DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，以預(yù)冷的無(wú)菌PBS 清洗細(xì)胞3 次，棄去PBS，向培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液200μl，充分震蕩，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞至1.5 ml EP 管中，4℃、15 000 r/min 離心10 min，上清液即為細(xì)胞全蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)。

1.7 復(fù)制單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型

24 只BACB/c 小鼠，雌雄不限，鼠齡6 ～8 周，體重18 ～20 g，由山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)： SYXK（魯）20180009。將24 只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）組及UUO+miR-381 組，每組8 只。小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.004 ml/g）麻醉約2 min 后，取仰臥位固定。術(shù)前消毒，于無(wú)菌條件下，取腹部正中白線為手術(shù)切口。UUO 組和UUO+miR-381 組尋找左側(cè)輸尿管并鈍性分離輸尿管至腎門(mén)，于小鼠腎臟下極和腎門(mén)處分別用絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管，并于兩結(jié)扎處之間剪斷輸尿管。右側(cè)輸尿管不予任何處理，縫合腹膜，消毒，縫合腹直肌和皮膚，再次消毒。假手術(shù)組小鼠除不結(jié)扎輸尿管外，其余操作與上述相同。UUO+miR-381 組尾靜脈注射40 mg/kg miR-381mimics 1 次/3 d，假手術(shù)組和UUO 組尾靜脈注射等量生理 鹽水。

1.8 Masson 染色

切取小鼠腎臟標(biāo)本并用固定液固定，浸蠟包埋，固定于切片機(jī)上切成3 ～5μm 薄片，按照說(shuō)明書(shū)分別采用蘇木精-伊紅染色和Masson 染色對(duì)3 組小鼠腎臟纖維化進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-381 在腎纖維化患者及小鼠UUO 模型體內(nèi)的表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果表明，miR-381 在腎纖維化患者、對(duì)照組血清中的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.324±0.047）和（1.000±0.122），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=53.035，P=0.000），腎纖維化患者低于對(duì)照組。UUO 組、假手術(shù)組小鼠腎臟組織中miR-381 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.417±0.062）和（1.000±0.208），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.030，P=0.000），UUO組低于假手術(shù)組。

2.2 Ang Ⅱ抑制NRK49F 細(xì)胞中miR-381 的表達(dá)

Ang Ⅱ組和空白組miR-381 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.324±0.047）和（1.000±0.122），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=53.035，P=0.000），經(jīng)Ang Ⅱ刺激后miR-381 在NRK49F 細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量低于 空白組。

2.3 miR-381 抑制α-SMA 的表達(dá)

miR-381 組、Ang Ⅱ組、空白組α-SMA 相對(duì)表達(dá)量為（0.762±0.089）、（1.127±0.154）、（0.519± 0.073），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.321，P=0.023），AngⅡ組高于miR-381組和空白組（t=3.554和6.179，P=0.024 和0.004）。

2.4 KLF-4 是miR-381 的靶基因

通過(guò)miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan 進(jìn)行篩選預(yù)測(cè)，確定miR-381 的潛在靶基因?yàn)镵LF-4（見(jiàn)圖1）。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-381 組與NC 組pMIR-WT 熒光活性分別為（0.437±0.043）和（1.000±0.126），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.324，P=0.002），miRNA-381 組低于NC 組；miRNA-381 組與NC 組pMIR-MUT 熒光活性分別為（0.951±0.012）和（1.121±0.164），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.791，P=0.148）。miR-381 可結(jié)合KLF-4 的3'-UTR 并抑制KLF-4的表達(dá)。

2.5 miR-381 負(fù)向調(diào)控KLF-4 mRNA 和蛋白的表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，miR-381 組、NC 組KLF-4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.335±0.029）和（1.000± 0.174），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.530，P=0.003），miR-381 組低于NC 組。

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-381 組、NC組KLF-4 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.166±0.074）和（0.385±0.049），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.274，P=0.013），miR-381 組低于NC 組（見(jiàn)圖2）。miR-381 能靶向調(diào)控KLF-4，且抑制KLF-4 mRNA 和蛋白的表達(dá)。

圖1 miR-381 與靶基因KLF-4 的序列關(guān)系

圖2 兩組KLF-4 蛋白的表達(dá)

2.6 miR-381 抑制腎纖維化因子mRNA 的表達(dá)

NC 組與miR-381 組腎纖維化因子α-SMA、CTGF、COL1A1 及COL3A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-381 組均低于NC 組。miR-381 能干擾TGF-β 信號(hào)通路，從而抑制腎纖維化的發(fā)展進(jìn)程。見(jiàn)表1。

表1 兩組腎纖維化因子mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 兩組腎纖維化因子mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 α-SMA mRNA CTGF mRNA COL1A1 mRNA COL3A1 mRNA NC 組 1.000±0.162 1.000±0.117 1.000±0.134 1.000±0.091 miR-381 組 0.614±0.076 0.403±0.054 0.482±0.082 0.267±0.045 t 值 3.736 8.025 5.711 12.506 P 值 0.020 0.001 0.005 0.000

2.7 miR-381 抑制UUO 小鼠腎纖維化發(fā)展進(jìn)程

Masson 染色發(fā)現(xiàn)，相比UUO 組，UUO+miR-381組小鼠腎纖維化區(qū)域減小，ECM 沉積變少（見(jiàn)圖3）。各組COL1A1 和COL3A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，UUO+miR-381 組低于UUO 組（t=5.340 和5.992，P=0.006 和0.004）。miR-381 抑制UUO 小鼠的腎纖維化發(fā)展進(jìn)程。見(jiàn)表2。

表2 3 組小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n =8，±s）

表2 3 組小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n =8，±s）

組別 COL1A1 mRNA COL3A1 mRNA假手術(shù)組 1.117±0.025 1.565±0.038 UUO 組 4.165±0.791 4.854±0.657 UUO+miR-381 組 1.649±0.201 2.411±0.259 F 值 10.023 9.327 P 值 0.004 0.005

圖3 miR-381 對(duì)腎纖維化的調(diào)控 （Masson 染色×100）

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是腎臟病變的病理基礎(chǔ)和最終途徑，其在多因素作用下，引起炎癥浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增生及ECM 在腎間質(zhì)沉積[9]，是腎衰竭特征之一。miRNA 是一類(lèi)非編碼單鏈小分子RNA，可調(diào)控人體30%編碼蛋白基因的表達(dá)。左琪等[10]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于無(wú)腎間質(zhì)纖維化患者，腎間質(zhì)纖維化患者尿中miR-21 升高，干預(yù)治療后miR-21 下降，纖維化程度減輕。劉亞楠等[11]在UUO 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)miR-192 在纖維化中起促進(jìn)作用。miRNA 靶點(diǎn)治療可以抑制或阻斷纖維化，避免腎臟替代治療。已有報(bào)道證實(shí)，miRNA與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，但miR-381 在腎間質(zhì)纖維化中的作用鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)纖維化患者血清miR-381 低于對(duì)照組，且在UUO 組小鼠腎組織中miR-381 低于假手術(shù)組。由此推斷，miR-381 可能參與腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程。

腎損傷時(shí)，Ang Ⅱ及其受體在成纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，刺激成纖維細(xì)胞增殖，促使ECM 生成及生長(zhǎng)因子分泌，發(fā)揮促纖維化作用。α-SMA 表達(dá)升高標(biāo)志上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使腎間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞聚集，導(dǎo)致ECM 合成和分泌增多，促進(jìn)纖維化形成。本研究通過(guò)Ang Ⅱ刺激NRK49F 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ組miR-381 低于空白組，且α-SMA 高于空白組，但miR-381 組α-SMA 低于Ang Ⅱ組，表明Ang Ⅱ促進(jìn)NRK49F 細(xì)胞中α-SMA 的表達(dá)，該作用可被miR-381 抑制。由結(jié)果得知miR-381 可抑制α-SMA 表達(dá)及Ang Ⅱ誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。

KLF 家族主要在胃腸道和其他上皮組織終末期細(xì)胞中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞分化增殖。KLFs 可作為轉(zhuǎn)錄激活子，或轉(zhuǎn)錄抑制子，有些KLF 因子兼有兩種功能。研究發(fā)現(xiàn)，KLF-4 是調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控蛋白[12]。本研究通過(guò)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)KLF-4是miR-381 潛在靶基因，采用雙熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-381 可抑制KLF-4 的表達(dá)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-381 可抑制KLF-4 mRNA和蛋白的表達(dá)。

CTGF 與腎臟、肺和肝臟等組織器官纖維化進(jìn)程有關(guān)，其在腎臟含量最高。CTGF 是TGF-β 促纖維化信號(hào)通路下游因子，刺激細(xì)胞增殖及ECM 形成，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[13-14]。ECM 主要成分包括Ⅰ、Ⅲ型膠原，COL1A1 和COL3A1 分別是Ⅰ、Ⅲ型膠原的組成部 分[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-381 組腎纖維化因子mRNA表達(dá)低于NC 組，說(shuō)明miR-381 抑制KLF-4 表達(dá)，并干擾TGF-β 信號(hào)通路，抑制腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程。Masson 染色顯示UUO+miR-381 組小鼠腎間質(zhì)纖維化區(qū)域小于UUO 組，ECM 沉積變少，纖維化進(jìn)程受到抑制。UUO+miR-381 組小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 低于UUO 組，表明miR-381 可抑制UUO 小鼠腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，miR-381 可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化，并下調(diào)腎纖維化基因表達(dá)。抑制UUO 小鼠腎間質(zhì)纖維化，提示miR-381 抑制KLF-4 表達(dá)，干擾TGF-β 信號(hào)通路，抑制腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程。因此，miR-381 可能成為腎間質(zhì)纖維化診斷及治療的新 靶點(diǎn)。