李淑潔

摘要：以大麥根尖為實驗材料，采用改良的苯酚品紅為染色液，在《遺傳學實驗》的基礎(chǔ)上探索適宜的預處理時間、解離時間和染色時間，省略了纖維素酶和果膠酶處理步驟，形成了一套快速、簡單的大麥根尖壓片方法，該方法獲得的染色體圖像清晰，便于計數(shù)，可用于大麥倍性鑒定和染色體變異方面的研究。

關(guān)鍵詞：大麥;根尖染色體;壓片方法

中圖分類號：S563.2;S182? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：1001-1463（2020）05-0032-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.05.009

An Improved Squash Technique of Barely Root-tip and

Its Application

LI Shujie

（Institute of Biotechnology， Gansu Academy of Agricultural Science， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In this study， barley root as experimental materials， the use of modified phenol fuchsine dye， on the basis of the genetics experiment， to explore suitable pretreatment time， dissociation time and dyeing time， cellulase and pectinase processing step is omitted， formed a set of barley root tablet method is rapid， simple， the method of chromosome image is clear， easy to count， can be used in barley ploidy identification and chromosome mutation research.

Key words：Barely（ Hordeum vulgare）;Chromosome number counting;Slide technique

大麥是世界上第四大作物，兼啤用、飼用、食用于一身，是我國的重要農(nóng)作物之一。甘肅省是我國重要的優(yōu)質(zhì)啤酒大麥生產(chǎn)基地之一，大麥產(chǎn)量占全國總量的1/3[1 ]。采用多代自交選育自交系的常規(guī)育種方法周期長、成本高，通常需要自交6～8 代，至少需要3 a以上時間。通過單倍體技術(shù)可將自交系選育時間縮短為1～2 a，大大加快育種進程;而且雙單倍體系（DH 系）完全純合，系內(nèi)變異來源于基因與環(huán)境互作，因而可以通過多點試驗代替多年試驗，更快速、更準確和更可靠的評價雙單倍體系，提高育種效率[2 ]。雙單倍體育種應用的關(guān)鍵是如何獲得大量的單倍體植株。自從1973年Clapham大麥花藥培養(yǎng)取得成功后[3 ]，花藥/小孢子培養(yǎng)、球莖大麥法獲得大麥單倍體的方法被相繼采用，并取得顯著效果。

染色體倍性鑒定是大麥雙單倍體育種的關(guān)鍵內(nèi)容之一，常用的植物染色體倍性鑒定采用氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法、流式細胞儀鑒定法和分生組織壓片染色體計數(shù)法[4 - 12 ]，其中根尖染色體壓片是植物倍性鑒定的最準確方法[13 ]。筆者以大麥根尖為實驗材料，在遺傳學實驗的基礎(chǔ)上，探索出了一種簡單、快速的大麥根尖染色體壓片技術(shù)，為大麥倍性鑒定和染色體變異研究奠定基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

實驗材料為成熟的大麥（Hordeum vulgare，2 n=14）種子。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 預處理? ? 取大麥種子浸種6 h以上，于20 ℃在濾紙上發(fā)芽，待根長1 cm左右時剪下根尖。根尖的預處理分以下4個方式：① 冰水混合物中處理16 h;② 0.002M 8-羥基喹啉溶液4 ℃處理2 h;③ 0.002M 8-羥基喹啉溶液4 ℃處理4 h;④ 0.002M 8-羥基喹啉溶液4 ℃處理6 h。預處理結(jié)束后蒸餾水淋洗數(shù)次。

1.2.2? ? 固定? ? 預處理結(jié)束后的根尖材料用卡諾式固定液（冰醋酸、無水乙醇體積比1∶3）固定14～24 h，保存于70%酒精中備用。

1.2.3? ? 解離? ? 固定的材料用蒸餾水沖洗數(shù)次，放入1.0 mol/L HCl溶液中，在60 ℃下解離5、10、15、20 min，以便胞間層的果膠類物質(zhì)解體，使細胞易于分散，便于壓片。解離結(jié)束后用蒸餾水淋洗數(shù)次。

1.2.4? ? 染色? ? 用改良苯酚品紅染色液染色10 min。

1.2.5? ? 壓片? ? 切取已染色的根尖分生組織約1.5 mm，蓋上蓋玻片，在蓋玻片上方用手指輕壓材料，吸水紙吸干多余染色液，再用鉛筆的橡皮頭垂直輕敲，使細胞分散。

1.2.6? ? 鏡檢? ? 根據(jù)李懋學等[14 ]提出的標準，尋找30個以上染色體清晰的細胞，統(tǒng)計20倍目鏡下各細胞的染色體數(shù)目。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同預處理對大麥根尖染色體制片的影響

根尖浸入冰水混合物中處理16 h后制片觀察，染色體長，且拖尾嚴重，不利于染色體計數(shù)。采用0.002 mol/L 8-羥基喹啉預處理2、4、6 h后，染色體隨著處理時間的延長而縮短，無染色體拖尾，易于計數(shù)。0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2 h，染色體較長，染色體間分散不理想，易粘連（圖1A）;0.002 mol/L 8-羥基喹啉預處理4 h，染色體長度適中，染色體分散良好，基本無粘連（圖1B）;0.002 mol/L 8-羥基喹啉預處理6 h，染色體長度短，染色體間分散好，無粘連，但不適于觀察染色體變異?？梢姶篼湼忸A處理采用0.002 mol/L 8-羥基喹啉于4 ℃處理4 h為宜。

2.2? ?解離時間對大麥根尖染色體制片的影響

采用1 mol/L HCl 在60 ℃下酸解10 min處理效果較好，單個細胞之間分散好，不易粘連在一起，染色體染色較深，呈深紅或紫紅色，易于染色體的辨認（圖2A）。1 mol/L HCl 在60 ℃下處理5 min，由于細胞解離不充分，細胞不易分散，往往造成許多細胞粘在一起（圖略）。1 mol/L HCl 在60 ℃解離15 min和20 min，雖然解離很充分，單個細胞容易分散，但是染色體由于解離時間長，染色體不易被染色（圖2B）?？梢姶篼湼饧毎怆x時間10 min為宜。

3? ?球莖大麥法獲得植株的根尖細胞染色體計數(shù)

李文澤、胡含[15 ]研究了栽培大麥×球莖大麥雜種后代的遺傳學后認為，利用栽培大麥和球莖大麥雜交可以獲得單倍體、二倍體及混倍體材料。采用改進的大麥染色體壓片方法，我們也得到了相同結(jié)論。圖3為栽培大麥和球莖大麥雜種后代的染色體壓片，其中有單倍體（n=7，圖3A）、二倍體（n=14，圖3B）、混倍體（n=21，圖3C;n=6，圖3D;n=8，圖3E;n=15，圖3F）。

4? ?結(jié)論與討論

根尖壓片法進行染色體計數(shù)，取材是獲得良好制片效果的基礎(chǔ)。筆者的試驗發(fā)現(xiàn)，以大麥根尖為材料，不同個體在24 h內(nèi)無固定重復出現(xiàn)的細胞分裂高峰時間，這與李瑜[16 ]、王吉明等[17 ] 報道不一致，推測這與實驗材料的生長狀態(tài)有關(guān)。處于一定生長時期、生長于大田或花盆的實驗材料其細胞分裂與環(huán)境溫度、光照密切相關(guān)，可能有一定的分裂高峰時間存在，但在濾紙上發(fā)芽的大麥材料處于恒定的環(huán)境（培養(yǎng)箱）中，沒有發(fā)現(xiàn)其分裂高峰時間的存在。本研究將國外大麥根尖壓片常用的冰水混合物處理16 h的預處理方法[3，18 ]與0.002 mol/L 8-羥基喹啉預處理2、4、6 h的效果進行了對比，發(fā)現(xiàn)8-羥基喹啉作為預處理試劑，將染色體縮短變直和累積中期染色體的效果優(yōu)于冰水混合物。

酶解離是針對一些根尖較硬材料的染色體壓片或具有小染色體的植物以核型分析和分帶為目的時采用的方法，即結(jié)束材料的預處理和固定后，用纖維素酶和果膠酶消化細胞壁的纖維素和細胞間的果膠類物質(zhì)，使染色體充分解離出來。陳瑞陽等[19 ]利用此方法對37科105種植物進行了試驗，結(jié)果表明，除蕨類和裸子植物未能取得很好的結(jié)果外，其他大部分被試材料都取得了良好的結(jié)果。本實驗材料大麥根尖較軟，在以染色體計數(shù)為目的，不需要做核型分析時，采用“預處理-固定-解離-染色-壓片”方法，可以獲得染色體數(shù)目清晰的壓片，同時可以節(jié)約成本和時間，提高工作效率。

再生株染色體倍性的快速、準確鑒定，是關(guān)乎到單倍體育種技術(shù)的有效利用以及植物細胞遺傳學研究、創(chuàng)新種質(zhì)分析等的重要問題。本研究在遺傳學經(jīng)典實驗的基礎(chǔ)上，省去了果膠酶和纖維素酶去除植物細胞壁步驟，通過研究預處理方法、解離時間獲得了良好的染色體分散相，建立了一種快速、簡單的大麥根尖染色體壓片方法，大大提高了球莖大麥法獲得的雜交后代的倍性鑒定效率。該方法鑒定的球莖大麥法后代植株的倍性已經(jīng)得到了田間驗證，同時也可用于大麥小孢子培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)等獲得的再生植株的倍性鑒定。

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（本文責編：楊? ? 杰）