王少賢 李振彬

【摘 要】目的：觀察膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠下丘腦視交叉上核（SCN）生物鐘基因Bmal1、Clock的表達(dá)變化，以及雷公藤多苷的調(diào)節(jié)作用。方法：建立CIA大鼠模型，隨機(jī)分為模型對照組、醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組，并設(shè)空白對照組，每組8只。醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組分別于20：00灌胃給藥，雷公藤多苷用藥量10.5 mg·kg-1·d-1，醋酸潑尼松片用藥量1.5 mg·kg-1·d-1;空白對照組、模型對照組灌服生理鹽水。連續(xù)給藥6周。觀測各組大鼠足爪、關(guān)節(jié)腫脹情況，ELISA法測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6水平，qRT-PCR和Western-blot法檢測SCN Bmal1、Clock基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)結(jié)束，與空白對照組比較，CIA模型大鼠左后踝關(guān)節(jié)圍長、足跖厚度、足趾容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分均明顯增加（P < 0.05），血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高（P < 0.05），下丘腦SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)均明顯下降（P < 0.05）。②與模型對照組比較，醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組均能明顯改善大鼠足爪、關(guān)節(jié)腫脹程度，降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，增加SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)（P < 0.05），雷公藤多苷組對SCN Bmal1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于醋酸潑尼松組（P < 0.05）。結(jié)論：關(guān)節(jié)炎的發(fā)病影響了血清炎性細(xì)胞因子和下丘腦SCN生物鐘的表達(dá);雷公藤多苷治療CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用機(jī)制與調(diào)控下丘腦SCN核心鐘基因表達(dá)和外周炎性細(xì)胞因子分泌水平相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;雷公藤多苷;下丘腦視交叉上核;生物鐘;Bmal1;Clock;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the expression of CLOCK and Bmall in suprachiasmatic nucleus（SCN）of hypothalamus in collagen induced arthritis（CIA）rats and the regulation of Tripterygium.Methods：The rat model of collagen induced arthritis was established and randomly divided into a model control group，a prednisone acetate group and a tripterygium glycosides group.There was a blank control group.There were 8 rats in each group.The prednisone acetate group and the tripterygium glycosides group were given intragastric administration at 20：00，respectively with dosage of 1.5 mg·kg-1·d-1 and 10.5 mg·kg-1·d-1，once a day.The blank control group and the model control group were given normal saline successively for?6 weeks.The paw and joint swelling of rats in each group were observed.ELISA was used to detected the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6.The gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN were detected?by qRT-PCR and Western-blot.Results：①At the end of the experiment，the left posterior ankle joint circumference，plantar thickness，toe volume，arthritis index（AI）scores of CIA model rats were significantly increased compared with the blank control group（P < 0.05）.Levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 were significantly increased（P < 0.05），and the gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN significantly decreased（P < 0.05）.②Compared with the model control group，the swelling degree of joint and paw could be significantly improved，the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 decreased and the gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN increased in the prednisone acetate group and the tripterygium glycosides group.The regulatory effect of in the tripterygium glycosides group on Bmall expression in SCN was better than that in the prednisone acetate group（P < 0.05）.Conclusion：The pathogenesis of arthritis affects the expression of serum inflammatory cytokines and hypothalamic SCN circadian clock;the mechanism of Tripterygium wilfordii polyglycoside in treating CIA model rats is related to the regulation of hypothalamic SCN core clock gene expression and peripheral inflammatory cytokine secretion level.

【Keywords】 collagen induced arthritis;tripterygium glycosides;suprachiasmatic nucleus of hypothalamus;biological clock;Bmall;Clock;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）為慢性全身性免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)如關(guān)節(jié)僵硬、疼痛、腫脹等晨起明顯，具有明顯的晝夜節(jié)律特點(diǎn);與RA相關(guān)的多種炎癥因子[白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6等]及抗炎因子（Cotisol）也呈現(xiàn)明顯的晝夜變化[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，這種節(jié)律變化與生物鐘基因表達(dá)變化密切相關(guān)[5-7]。

本研究擬觀察雷公藤多苷對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠下丘腦視交叉上核（SCN）生物鐘基因Clock、Bmal1的表達(dá)，以及模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥和外周血炎性細(xì)胞因子的變化，旨在從生物鐘基因角度探討雷公藤多苷治療RA的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠60只，6～7周齡，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK（京）2016-0011。清潔級動物房飼養(yǎng)，室溫（21±1）℃，相對濕度40%～60%，固定光照明、暗各12 h（明7：00～19：00，暗19：00～7：00），自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)通過中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)過程中盡可能減少動物的痛苦和死亡。

1.2 藥 物 雷公藤多苷（純度98%，南京澤郎生物科技有限公司，生產(chǎn)批號ZL170225-LGTDG）;醋酸潑尼松片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號160813201）;雷公藤多苷和醋酸潑尼松片均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解灌胃給藥。

1.3 主要試劑和儀器 弗氏完全佐劑（美國Sigma-Aldrich公司，貨號F-5881）;牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex公司，貨號20022）;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6 ELISA kit（德國IBL International GmbH公司，貨號分別為BE45471、BE45411、BE45361）;TRNzol Universal總RNA提取試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastFire快速熒光定量PCR預(yù)混試劑（SYBR Green）、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號分別為DP424、KR118、FP207、PA115];RIPA Buffer（美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號89900）;β-actin小鼠單克隆一抗（英國Abcam公司，貨號ab8226）;Clock小鼠單克隆一抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司，貨號sc-271603）;Bmal1小鼠單克隆一抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司，貨號sc-373955）;二抗羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體（IgG-HRP，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZDR-5307）;YLS-7C足趾容積測量儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，3K15型）;低溫離心機(jī)（德國Sigma公司，ND2000型）;微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）;7300實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國ABI公司）;凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.4 CIA大鼠模型制備與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)

1周，根據(jù)體質(zhì)量編號隨機(jī)分為空白對照組8只，造模組52只。將弗氏完全佐劑與含牛Ⅱ型膠原的0.05 mol·L-1醋酸溶液等體積振蕩混勻，充分乳化，最終膠原含量為1 mg·mL-1。于造模組大鼠右后足爪、背部、尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原溶液0.2 mL，第15天每只大鼠再次注射膠原溶液0.1 mL，加強(qiáng)免疫?？瞻讓φ战M大鼠在相同部位注射等體積生理鹽水。關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分采用5級評分法評定[8]。0分，關(guān)節(jié)、足趾無紅腫;1分，趾關(guān)節(jié)紅腫;2分，足趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹;4分，踝關(guān)節(jié)和足爪均明顯腫脹。每只大鼠單肢評分最高4分，四肢累計得分為AI評分，最高16分。

AI評分≥4分視為造模成功[9]。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笫状蚊庖咦⑸浜蟮?1天AI評分≥4分共計30只（占57.69%），隨機(jī)分為模型對照組、醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組，每組10只。最終每組納入8只大鼠進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 給藥方法 雷公藤多苷組、醋酸潑尼松組分別于20：00灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組、模型對照組灌服生理鹽水。按照大鼠與70 kg成人體質(zhì)量折算系數(shù)為7計算大鼠每日用藥量，雷公藤多苷組用藥量10.5 mg·kg-1·d-1（雷公藤多苷組成人用量1.5 mg·kg-1·d-1），每日1次;醋酸潑尼松片用藥量1.5 mg·kg-1·d-1（醋酸潑尼松片成人每日15 mg），每日1次。連續(xù)給藥6周后取材。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 足爪、關(guān)節(jié)腫脹情況 觀察比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠左后足趾容積、足跖厚度、踝關(guān)節(jié)圍長并評定四肢AI得分，綜合評定治療用藥后大鼠足爪和關(guān)節(jié)腫脹變化程度。左后足爪容積、足跖厚度、踝關(guān)節(jié)圍長測定：采用足趾容積測量儀測量每只大鼠左后足趾容積（mL），游標(biāo)卡尺測定左后足跖厚度、踝關(guān)節(jié)圍長（mm）。

1.6.2 ELISA法測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔麻醉大鼠，斷頭，取血，離心機(jī)在4 ℃以3500 r·min-1離心20 min，離心半徑8.2 cm，分離血清，按照試劑盒說明，測定各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.3 qRT-PCR和Western-blot法檢測SCN中Bmal1、Clock基因和蛋白表達(dá) 取血同時，快速取腦，液氮速凍，摳取SCN組織，進(jìn)行qRT-PCR和Western-blot檢測。

1.6.3.1 qRT-PCR主要步驟 ①總RNA提?。捍笫骃CN組織50 μg，加入1 mL TRNzol Universal試劑提取總RNA。②cDNA合成：根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，配置20 μL反應(yīng)體系：5× FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNA提取液5 μL（含total RNA 1 μg/樣本），RNase-Free dd H2O 11 μL。

于PCR儀上，42 ℃ 15 min，然后95 ℃加熱3 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×FastFire qPCR PreMix 25 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，cDNA模板1 μL，ROX Reference Dye 5 μL，去離子水16 μL。DNA模板預(yù)變性95 ℃ 1 min，然后PCR反應(yīng)40個循環(huán)：變性95 ℃ 5 s，模板與引物退火58 ℃ 10 s，引物延伸72 ℃ 31 s，于72 ℃引物延伸時采集熒光信號。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。β-actin：上游引物（5'至3'）GGTCATCACCATTGGCAA，下游引物（5'至3'）GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA，105 bp。Clock：上游引物（5'至3'）TCGGCAGCAAGAAGAACTAAG，下游引物（5'至3'）AGAACCAAGATTCAGTCCAGG，109 bp。Bmal1：上游引物（5'至3）TGCCACCAACCCATACAC，下游引物（5'至3'）CCTCGGTCACATCCTACGAC，120 bp。β-actin為內(nèi)參照基因。PCR擴(kuò)增完畢后，采用SDSV 1.3軟件分析獲得Ct值，根據(jù)RQ = 2-△△Ct計算各樣本Clock、Bmal1 mRNA相對表達(dá)量（RQ值），其中空白對照組1號樣本RQ值被設(shè)定為1。各樣本RQ值最終納入統(tǒng)計分析。

1.6.3.2 Western-blot主要步驟 ①提取總蛋白：SCN組織置EP管，加RIPA Buffer 1 mL勻漿，冰浴反應(yīng)30 min，充分裂解，離心機(jī)以8000 r·min-1離心10 min，離心半徑8.2 cm，取上清，提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明進(jìn)行蛋白濃度測定。②電泳、轉(zhuǎn)膜：30 μg? 蛋白/樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離目標(biāo)蛋白條帶，然后電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。③封閉：轉(zhuǎn)膜完畢，蒸餾水振蕩沖洗5 min × 3次，以5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min。④一抗、二抗孵育：TTBS洗膜5 min×3次，加Clock（1∶300）或Bmal1（1∶300）或β-actin（1∶500）一抗，4 ℃孵育過夜;TTBS洗膜5 min×3次，加入1∶3000羊抗小鼠IgG-HRP，4 ℃孵育60 min。⑤蛋白檢測：TTBS室溫洗膜10 min×3次，TBS洗膜5 min，化學(xué)發(fā)光法檢測獲得目標(biāo)條帶，凝膠成像系統(tǒng)成像。β-actin為參照條帶，采用Image-Pro Plus 6.0分析目標(biāo)條帶積分光密度值（IOD），以IOD目標(biāo)條帶/IODβ-actin公式計算Bmal1、Clock蛋白表達(dá)相對含量，納入統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊組間比較采用SNK-q法，方差不齊組間比較采用Dunnett's T3法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠足爪、關(guān)節(jié)腫脹程度比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，CIA模型大鼠左后踝關(guān)節(jié)圍長、足跖厚度、足趾容積、四肢AI評分均較空白對照組大鼠明顯增加（P < 0.05）;醋酸潑尼松組和雷公藤多苷組大鼠左后足爪各個指標(biāo)均明顯下降（P < 0.05），2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，ELISA法測得CIA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平較空白對照組大鼠均明顯升高（P < 0.05）;醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組均可降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;醋酸潑尼松組與雷公藤多苷組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠下丘腦SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠下丘腦SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)均明顯下降（P < 0.05）;雷公藤多苷組、醋酸潑尼松組SCN Bmal1、Clock表達(dá)較模型對照組均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;雷公藤多苷組大鼠SCN Bmal1、Clock表達(dá)較醋酸潑尼松組均有所增加，且Bmal1表達(dá)2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3和圖1。

3 討 論

自20世紀(jì)60年代至今，RA晝夜節(jié)律特點(diǎn)和機(jī)制受到越來越多學(xué)者關(guān)注。RA患者臨床癥狀晝輕夜重的規(guī)律特征，與體內(nèi)炎性細(xì)胞因子、褪黑素（MLT）、糖皮質(zhì)激素的晝夜振蕩有關(guān)[10]。課題組前期研究和相關(guān)研究文獻(xiàn)均表明，IL-6、TNF-α、IL-1、巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）等炎性因子分泌水平在2：00～7：00達(dá)到高峰[11-17]，MLT也在凌晨達(dá)到高峰[18]，并且MLT會刺激IL-6等促炎細(xì)胞因子分泌增加以加重RA病情[19-20];另一方面，內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素在RA患者機(jī)體內(nèi)分泌嚴(yán)重不足，且在夜間降至最低水平，皮質(zhì)醇作為體內(nèi)關(guān)鍵抗炎物質(zhì)，則在夜間無法抑制持續(xù)的免疫炎癥反應(yīng)[21]，導(dǎo)致RA癥狀夜間加重，晨起關(guān)節(jié)僵硬不適等表現(xiàn)明顯。

除外體內(nèi)炎性因子和激素水平變化與RA病變密切相關(guān)，生物鐘也深度參與了RA的病理過程[5，21-25]。在分子水平上，生物鐘由高度進(jìn)化保守的基因控制，包括激活因子（Clock和Bmal1）和抑制因子（Per1/2和Cry1/2）[22]。缺乏生物鐘調(diào)節(jié)的小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)形態(tài)異常和對炎癥性關(guān)節(jié)炎的敏感性增加[23-24]，關(guān)節(jié)炎病理過程中通常在分離的軟骨細(xì)胞中觀察到促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF-α等）并伴隨著鐘基因表達(dá)中斷[25]，提示晝夜節(jié)律、炎癥和關(guān)節(jié)炎之間存在密切關(guān)系[26]。在原代培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞中，TNF-α可通過雙鈣依賴途徑調(diào)節(jié)Bmal1表達(dá)[27]，TNF-α還可通過D-box結(jié)合蛋白在RA滑膜細(xì)胞中調(diào)控Per2基因的表達(dá)[28]，從而參與RA的發(fā)病機(jī)制。有研究報道，RA患者血樣中白細(xì)胞Clock基因的表達(dá)，可作為預(yù)測改善病情抗風(fēng)濕藥物如TNF抑制劑、IL-6抑制劑、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4在RA治療中的疾病活性和療效的生物標(biāo)志物[29]。鐘基因變化可影響炎性細(xì)胞因子的分泌規(guī)律和濃度水平，同時炎性細(xì)胞因子的異常又可擾亂鐘基因的表達(dá)，鐘基因與炎性細(xì)胞因子相互影響，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥狀加重。

在哺乳動物體內(nèi)，位于下丘腦前部的SCN是生物鐘晝夜節(jié)律的起搏點(diǎn)，可通過神經(jīng)和激素信號通路對外周生物鐘進(jìn)行調(diào)節(jié)[30]，而Clock和Bmal1為SCN中整個晝夜節(jié)律生物鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的核心鐘基因和原始動力[31-32]。本研究觀測到伴隨踝關(guān)節(jié)、足爪的明顯腫脹和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，CIA模型大鼠下丘腦SCN中Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)均明顯下降，說明關(guān)節(jié)炎的發(fā)病不但促使炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加，同時也影響了核心鐘基因的表達(dá)。

雷公藤多苷是從雷公藤根中提取的一種總皂苷，是雷公藤抗炎、免疫調(diào)節(jié)的主要活性成分[33]。目前，雷公藤多苷在臨床已被廣泛應(yīng)用于治療RA等炎癥性疾病，系統(tǒng)評價雷公藤多苷聯(lián)合改善病情抗風(fēng)濕藥物可明顯減輕RA患者關(guān)節(jié)腫脹程度、疼痛評分和握力、晨僵程度，降低紅細(xì)胞沉降率和C-反應(yīng)蛋白水平[34-35]。機(jī)制研究表明，雷公藤多苷可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞、酶類、核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子分泌和炎癥通路的激活，抑制血管生成和誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，保護(hù)軟骨和基因調(diào)控等方面發(fā)揮抗RA作用[36-39]。本課題組近年來致力于RA晝夜節(jié)律變化及雷公藤多苷藥效機(jī)制研究，前期觀測到雷公藤多苷、來氟米特在炎癥上升期擇時用藥可以更加有效地抑制炎癥、減緩病情[11-12]，但其分子機(jī)制有待深入研究。

本研究初步觀察到雷公藤多苷、醋酸潑尼松在20：00給藥均能明顯降低CIA大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平和增加下丘腦SCN鐘基因Bmal1、Clock的表達(dá)。提示雷公藤多苷臨床治療RA的作用機(jī)制，可能與調(diào)控SCN核心鐘基因表達(dá)和外周炎性細(xì)胞因子分泌水平相關(guān)，但下丘腦CNS核心鐘基因與外周關(guān)節(jié)炎這一“腦-關(guān)節(jié)軸”之間復(fù)雜的相互作用及其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2020-04-20;修回日期：2020-05-30