張愛芹，王 嫚，申剛義，金 軍

（1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,2.中央民族大學(xué)藥學(xué)院,北京100081）

多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）類溴代阻燃劑由于蒸汽壓低、親脂性強，能通過遠(yuǎn)距離遷移和生物蓄積進入人體產(chǎn)生多種毒副作用及致癌性，已成為威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康的全球性環(huán)境污染物［1～3］. PBDEs主要通過皮膚接觸、呼吸、飲水和食物等多種途徑進入生物體并產(chǎn)生對疾病相關(guān)通路的干擾，是其產(chǎn)生健康危害的起點［4］. 目前，對PBDEs與受體蛋白以及遺傳物質(zhì)等生物分子的交互作用機制的認(rèn)識仍不足，難以揭示其在生物體內(nèi)導(dǎo)致毒性效應(yīng)并與特定疾病表型相關(guān)聯(lián)的途徑及機制. 探明PBDEs在體內(nèi)暴露水平、分布及其對毒性作用通路的擾動機制已成為探索環(huán)境暴露與健康危害因果聯(lián)系的關(guān)鍵問題.

人血清白蛋白（HSA）作為血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，是污染物在人體血液中的主要轉(zhuǎn)運媒介［5］. 污染物進入人體后與HSA 形成復(fù)合物，繼而被轉(zhuǎn)運到受體部位或靶器官而產(chǎn)生生理毒理作用.研究PBDEs 與HSA的相互作用對深入了解污染物的致毒機制具有重要意義［6，7］. 研究者們利用光譜和計算機模擬對PBDEs與HSA相互作用的熱力學(xué)機制進行了研究［8～11］. 然而，在對于揭示污染物體內(nèi)蓄積、分布、代謝等過程中起關(guān)鍵作用的污染物-蛋白相互作用的動力學(xué)速率、強弱等機制方面尚未明確，系統(tǒng)探究不同取代基個數(shù)和位置的PBDEs與HSA相互作用的差異及規(guī)律，對從分子結(jié)構(gòu)層次理解PBDEs的毒理學(xué)機制具有重要意義.

表面等離子體共振技術(shù)（SPR）是一種免標(biāo)記型光學(xué)生物傳感方法，在研究生物分子相互作用方面具有獨特優(yōu)勢［12］. 其具有微量化、高靈敏、通用性好及實時快速等優(yōu)點，還可同時獲得相互作用過程的動力學(xué)和熱力學(xué)信息，便于在模擬生理條件下探究分子相互作用的整個過程［13，14］. 本文以HSA為受體模型，以8 種典型PBDEs 同族體（BDE28，BDE47，BDE99，BDE100，BDE153，BDE154，BDE183，BDE209）為分析對象，利用SPR技術(shù)在模擬生理條件下實時動態(tài)研究了它們之間的相互作用；結(jié)合計算機輔助分子對接模擬，從理論角度探討了兩者的相互作用機制，并與實驗結(jié)果相互驗證. 基于HSA建立的研究方法和模型，將適用于PBDEs與脂蛋白或受體蛋白相互作用的研究.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

GLH傳感芯片和偶聯(lián)試劑盒［N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）、N-乙基-N′-（二甲氨基丙基）碳二亞胺（EDC）和1.0 mol/L 鹽酸乙醇胺（pH=8.5）均為分析純］購自美國BioRad 公司；HSA（純度≥96.0%）購自美國Sigma 公司；8 種PBDEs 標(biāo)準(zhǔn)品（BDE28，BDE47，BDE99，BDE100，BDE153，BDE154，BDE183，BDE209）購自美國Accustandard 公司；二甲基亞砜（DMSO）、吐溫20、Na3PO4、NaCl、HCl和醋酸均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司.

ProtenOn XPR36生物分子相互作用系統(tǒng)（美國BioRad公司）；PB-10 型pH計（德國Sartorius公司）；XP205型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Mini離心機（北京昊諾斯公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 樣品的配制 固定蛋白運行緩沖液（PBST）為含150 mmol/L NaCl 和0.005%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫20的10 mmol/L Na3PO4溶液（pH=7.4）；相互作用運行緩沖液（PBSTD）為含5%（體積分?jǐn)?shù)）DMSO的PBST.

將各分析物溶于DMSO中形成母液，用PBSTD稀釋至20 μmol/L（BDE-209為100 μmol/L），再依次按3倍倍比稀釋4次得5組濃度梯度（0.25，0.74，2.22，6.67，20 μmol/L），另設(shè)一個PBSTD作空白對照，組成6組梯度濃度. 所有溶液使用前均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾.

1.2.2 HSA芯片的固定 蛋白固定采用氨基偶聯(lián)法：25 ℃下，將0.1 mol/L Sulfo-NHS和0.4 mol/L EDC 1∶1（體積比）混合并流過芯片通道，流速25 μL/min，時間360 s；將0.68 mg/mL 的HSA 醋酸緩沖溶液（pH=4.5）以相同流速流過芯片通道，與芯片上活化的羧基反應(yīng)，時間360 s；鹽酸乙醇胺以相同流速流過芯片通道，時間360 s；通入PBST去除非特異性吸附. 同時設(shè)置第2個通道作為對照通道（只活化封閉而不固定蛋白）.

1.2.3 PBDEs與HSA相互作用的動態(tài)測試 在25 ℃下，同一分析物的6組梯度濃度以25 μL/min流速垂直流過固定蛋白通道并與HSA作用，實時監(jiān)測采集信號. 相互作用的結(jié)合時間為240 s，解離360 s.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用雙參比和體積排除法，扣除空白通道和空白溶液的背景信號和溶劑效應(yīng). 利用ProtenOn Manager 2.1.2軟件進行數(shù)據(jù)分析處理.

1.2.5 PBDEs 與HSA 的分子對接模擬 采用AutoDock［15，16］對PBDEs 與HSA 的對接進行模擬，采用AutoDockTools［17］和PyMOL［18，19］進 行 對 接 結(jié) 果 展 示 和 分 析. HSA 晶 體 結(jié) 構(gòu)（PDB ID：1AO6）取 自Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫［20］，PBDEs取自小分子數(shù)據(jù)庫［21］. 每種PBDE與HSA隨機100次分子對接，對能量的優(yōu)化采用拉馬克遺傳算法（LGA），選取得分權(quán)重最高構(gòu)象作為最終對接結(jié)果. 通過結(jié)合自由能（ΔG）對PBDEs與HSA的作用進行評價.

2 結(jié)果與討論

2.1 PBDEs與HSA相互作用的動力學(xué)分析

將HSA作為受體，其固定量大小對相互作用有直接影響. 圖1給出了HSA在芯片表面實時固定的動態(tài)過程，其結(jié)合速率很快，50 s內(nèi)即達(dá)到平衡，最終標(biāo)記量為22000 RU（22 kRU），表明HSA在芯片表面的固定量約為22 ng/mm2［22］，適合與小分子相互作用研究.

圖2為8種PBDEs與HSA實時相互作用的動力學(xué)傳感圖，示出了結(jié)合和解離的整個動態(tài)過程. 在結(jié)合起始階段，分析物濃度越高則復(fù)合物越多，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時響應(yīng)值不再增加. 而在解離階段，復(fù)合物分解同時響應(yīng)值降低，復(fù)合物濃度越高解離越多.

依據(jù)Langmuir模型，分析物與HSA的作用遵循準(zhǔn)一級反應(yīng)：

Fig.1 Immobilization of HSA on the surface of a sensor chip at 25 ℃

Fig.2 Real?time sensorgrams of kinetic analysis of the interactions between PBDEs and HSA at 25 ℃

式中：A為分析物；B為芯片上固定的HSA；A-B為芯片上生成的復(fù)合物；ka（L·mol?1·s?1）為結(jié)合速率常數(shù)；kd（s?1）為解離速率常數(shù).

結(jié)合階段動力學(xué)方程為

式中：［A-B］（mol/L）為反應(yīng)時間t（s）時芯片上復(fù)合物的濃度，對應(yīng)于t時的響應(yīng)值；［A］（mol/L）為分析物濃度；［B］（mol/L）為反應(yīng)時間t時芯片表面未被結(jié)合蛋白的濃度，定義如下：

式中：［A-B］max為芯片上A與B結(jié)合達(dá)到飽和時復(fù)合物的濃度，對應(yīng)最大響應(yīng)值Rmax.

將式（3）帶入式（2）得：

對動力學(xué)曲線進行平滑擬合（圖2平滑曲線）并結(jié)合上述公式，可計算相互作用過程的各動力學(xué)參數(shù)（見表1）.ka和kd反映了分析物與HSA 相互作用動力學(xué)結(jié)合和解離速率的快慢.KD可反映結(jié)合力或親和力的大小，KD越小親和力越大.

通過比較可見，BDE209與HSA相互作用的動力學(xué)過程［圖2（H）］與其它PBDEs 有明顯差異. 在結(jié)合階段，ka（0.30×103）明顯小于其它化合物，生成的復(fù)合物量較少. 解離階段kd（0.98×10?2）也明顯減慢，復(fù)合物較難解離，解離時間結(jié)束時（360 s）尚未完全解離.受動力學(xué)結(jié)合速率和解離速率共同影響，其親和力明顯小于除BDE28外的其它6種（表1）.

實驗發(fā)現(xiàn)，PBDEs中溴原子個數(shù)及取代位置的差異對相互作用有規(guī)律性的影響. 首先，隨溴原子個數(shù)增加（從BDE28，BDE47，BDE 99，BDE 153 到BDE 183，依次為三溴至七溴）相互作用的解離速率逐漸減慢，親和力依次增大. 表明溴原子個數(shù)增加有利于PBDEs 與HSA 的相互作用. 基于動力學(xué)分析，顯示可能與溴原子個數(shù)增加減緩了復(fù)合物的解離速率有關(guān).

其次，對溴原子不同取代位置的同分異構(gòu)體比較發(fā)現(xiàn)，間位溴的BDE99與HSA的ka（5.77×103）明顯大于鄰位溴的BDE100（ka=1.14×103）. 前者達(dá)到結(jié)合平衡所需時間［圖2（C），約30 s］遠(yuǎn)快于后者［圖2（D），約100 s］. 在解離階段，BDE99的kd（3.92×10?2）大于BDE100（kd=1.76×10?2）. 由于結(jié)合速率差異更大，BDE99 與HSA 的親和力（KD=0.68×10?5）大于BDE100（KD=1.54×10?5）的. 同樣，PBDE153（間位溴）與HSA的親和力也大于BDE154（鄰位溴）的. 表明在PBDEs的同分異構(gòu)體中，間位溴比鄰位溴利于PBDEs與HSA的相互作用. 動力學(xué)分析顯示這種差異可能源自結(jié)合速率快慢的影響.

2.2 PBDEs與HSA相互作用的穩(wěn)態(tài)分析

穩(wěn)態(tài)為結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時的狀態(tài)，可根據(jù)反應(yīng)平衡分析PBDEs與HSA相互作用的親和力.

根據(jù)式（1），穩(wěn)態(tài)時復(fù)合物形成與解離的速率相等：

其中，［A］eq和［B］eq分別為平衡時分析物濃度和芯片表面未被結(jié)合的蛋白濃度；［A-B］eq為平衡時復(fù)合物的濃度，對應(yīng)平衡時的響應(yīng)值.

將式（7）代入式（5）可得：

Table 1 Kinetic parameters of interactions between PBDEs and HSA

由于［B］eq=［A-B］max?［A-B］eq，代入式（8）可得：

當(dāng)［A］eq=KD時：

即KD等于最大復(fù)合物濃度一半對應(yīng)的分析物濃度，等同米氏常數(shù)KM. 將每種分析物的6個濃度梯度與平衡時的響應(yīng)值作圖，擬合后計算結(jié)果列于表2. 其中，Rmax為最大響應(yīng)值，Chi2為評估曲線擬合的卡方值. 可見，穩(wěn)態(tài)分析的親和力數(shù)據(jù)和動力學(xué)數(shù)據(jù)（表1）基本一致（線性相關(guān)系數(shù)R2=0.945），驗證了該方法的可靠性.

Table 2 Affinity parameters of interactions between PBDEs and HSA based on the steady state analysis

2.3 PBDEs與HSA分子對接模擬

利用分子對接技術(shù)從微觀角度分析了PBDEs 與HSA 的作用模式和結(jié)合位點. 外源性物質(zhì)與HSA的結(jié)合位點主要位于Site I（IIA）和Site II（IIIA）［23，24］. 分子對接結(jié)果顯示，8 種PBDEs 均結(jié)合于HSA 的Site I處，與文獻(xiàn)［25］報道一致，并且它們主要位于由Leu，Trp，Ile，Phe，Val和Tyr等多種疏水性氨基酸殘基構(gòu)成的疏水空腔內(nèi). 圖3 顯示了3 種PBDEs（BDE28，BDE154 和BDE183）與HSA 的分子對接三維圖. 可見，PBDEs雖然都位于Site I處，但它們的最佳構(gòu)象不同，其在空腔中存在不同的平動轉(zhuǎn)動等方式，空腔功能區(qū)周邊的氨基酸活性位點存在差異，因此分子間疏水力、范德華力、氫鍵以及靜電力等相互作用力不同，綜合導(dǎo)致它們與HSA結(jié)合力不同.

Fig.3 3D molecular docking images of BDE28(A),BDE154(B),BDE183(C)and HSA at 25 ℃

進一步分析了8種PBDEs與HSA分子對接最佳構(gòu)象的各種熱力學(xué)參數(shù)（表3），發(fā)現(xiàn)范德華力和氫鍵作用力對結(jié)合能的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于靜電力. 比較可發(fā)現(xiàn)，PBDEs結(jié)構(gòu)中溴原子的個數(shù)及取代位置的差異會使其與HSA的結(jié)合能有明顯差異. 除BDE209外，范德華力和氫鍵作用力及結(jié)合能均隨溴原子的增加依次增強，與實驗親和力（表1）和文獻(xiàn)［11］趨勢相同，這可能是由于溴原子的引入能促進分子間作用力增強. 而對于同分異構(gòu)體，間位溴取代的BDE99比鄰位溴取代的BDE100具有更大的范德華力和氫鍵作用力，同時靜電引力也要略大于鄰位，從而使間位溴取代的BDE99 與HSA 的結(jié)合能（?ΔG=33.23 kJ/mol）大于鄰位溴的BDE100（?ΔG=32.14 kJ/mol）. 類似地，間位溴BDE153（?ΔG=35.53 kJ/mol）也大于鄰位溴BDE154（?ΔG=34.40 kJ/mol）. 與實驗結(jié)果趨勢相同. 這可能是位于醚鍵的鄰位溴取代相比于間位溴取代增強了分子的剛性而降低了其柔性，產(chǎn)生了更大的位阻效應(yīng)，限制了其結(jié)合的最佳結(jié)合構(gòu)象，從而使其與周邊氨基酸殘基作用力減弱. 而對于BDE209，雖然溴原子的增加有利于與HSA結(jié)合，但其分子中圍繞著醚鍵共有4個鄰位溴，剛性大柔性小，空間位阻顯著增大，大大阻礙了與HSA的結(jié)合，致使親和力變小. 而BDE209與HSA的親和力大于BDE28可能是溴原子個數(shù)和取代位置綜合作用的結(jié)果. 分子對接結(jié)果與利用SPR測定PBDEs與HSA相互作用的實驗結(jié)論一致.

Table 3 Theoretical and experimental thermodynamic parameters of the interactions between PBDEs and HSA

根據(jù)?RTlnKA=ΔG和KA=1/KD，可得實驗中PBDEs和HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)吉布斯自由能ΔG.從表3 可見，無論是實驗還是理論計算結(jié)果，各PBDEs 和HSA 相互作用的ΔG均小于0，表明它們與HSA的反應(yīng)可自發(fā)進行. 實驗ΔG值小于理論值，數(shù)據(jù)間有較好的相關(guān)性（R2=0.784），顯示兩種方法具有較好的一致性.

3 結(jié) 論

采用SPR和分子對接技術(shù)分析了8種PBDEs與HSA 的相互作用. 利用SPR技術(shù)不僅可通過動態(tài)曲線直觀揭示不同PBDEs與HSA的相互作用，還可獲得相互作用過程的動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù). 實驗結(jié)果表明，PBDEs中溴原子的個數(shù)和取代位置對PBDEs與HSA作用有規(guī)律性的影響. 動力學(xué)分析顯示同分異構(gòu)體結(jié)合力的差異可能主要源自結(jié)合速率的快慢. 分子對接結(jié)果顯示，8種PBDEs在HSA結(jié)合位點Site I處周邊功能區(qū)的氨基酸殘基類型存在差異. 范德華力和氫鍵在結(jié)合能的貢獻(xiàn)大于靜電力. 實驗熱力學(xué)參數(shù)和計算模擬相互印證. 本研究基于HSA建立的方法同樣適用于PBDEs 與脂蛋白或受體蛋白等，為探索污染物與人體內(nèi)生物大分子蛋白的相互作用提供了技術(shù)途徑.