李雪，趙昕，靳夢(mèng)彤，唐浩，張盈，黃新祥

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 南京市第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210006)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S. Typhi)是一種以人類為唯一宿主的腸道致病菌，主要通過(guò)受污染的食物或水經(jīng)消化道入侵人體，突破免疫防御引起全身性感染(傷寒)[1- 2]。S. Typhi可黏附在某些非生物固體甚至人體膽石表面，形成大量高度組織化、系統(tǒng)化的細(xì)菌群落——生物膜，該膜結(jié)構(gòu)的形成能夠使細(xì)菌抵抗環(huán)境壓力和抗生素，并逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，增強(qiáng)其在宿主體外的傳播持久性及體內(nèi)定植[3]。生物膜的形成受到龐大而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，包括許多轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，例如雙組分調(diào)節(jié)體系，σ因子和非編碼RNA等[4- 5]。

RNA不具有編碼功能，廣泛存在于各種微生物及動(dòng)植物。多種細(xì)菌中均已鑒定出多種具有調(diào)控作用的非編碼RNA(ncRNA)[6]，它們大多通過(guò)與對(duì)側(cè)或遠(yuǎn)端靶mRNA形成完全或不完全堿基配對(duì)的方式來(lái)發(fā)揮作用[7-8]。本課題組前期利用RNA-seq技術(shù)對(duì)生物膜及浮游狀態(tài)的S. Typhi進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)ncRNA GlmY在生物膜中的表達(dá)水平明顯高于浮游菌(尚未發(fā)表)。GlmY可與ncRNA GlmZ 協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)胞內(nèi)葡萄糖胺-6-磷酸的含量[9],但其在細(xì)菌生物膜形成中的作用尚未可知，因此本研究擬探討GlmY對(duì)S. Typhi生物膜形成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

傷寒沙門菌野生株S. Typhi GIFU10007、E.coliλ372和自殺質(zhì)粒pGMB151由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng)；E.coliDH5α、glmY缺陷株、回補(bǔ)株、空質(zhì)粒對(duì)照株由本實(shí)驗(yàn)室制備或保存；pBAD/myc-HisA為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(德國(guó)Oxoid公司)；限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ，T4DNA連接酶(大連TaKaRa公司)；Trizol、氯仿(美國(guó)Sigma公司)；超保真DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)。凝膠成像儀(美國(guó)Gene Genius Bio Imaging System)；核酸紫外檢測(cè)儀(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems?2720)；cfx96熒光定量PCR儀，電轉(zhuǎn)化儀均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。設(shè)計(jì)各種引物，具體見(jiàn)表1，下劃線為酶切位點(diǎn)/接頭序列。引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。

1.3 glmY缺陷株構(gòu)建

S. TyphiglmY缺陷株依照參考文獻(xiàn)方法構(gòu)建[10]，分別設(shè)計(jì)glmY上下游特異性引物P1A/P1B、P2A/P2B，以S. Typhi 野生株DNA為模板，用重疊PCR獲得重組片段，并插入自殺質(zhì)粒 pGMB151BamH Ⅰ位點(diǎn)，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入S. Typhi野生株，經(jīng)5%蔗糖板傳代培養(yǎng)篩選，獲得穩(wěn)定重組的glmY缺陷株。

表1 引物序列

1.4 細(xì)菌生物膜形成檢測(cè)

細(xì)菌生物膜形成實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11]，分別將野生株和glmY缺陷株接種于20 mL胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基培養(yǎng)至D(600 nm)=0.4。離心收集菌體，用TSB重懸并轉(zhuǎn)種入96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板，30℃靜置培養(yǎng)96 h。實(shí)驗(yàn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 細(xì)菌總RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)

細(xì)菌總RNA提取及qRT-PCR依照參考文獻(xiàn)[11]，分別挑取待測(cè)菌株的單菌落以“1.4”中方法培養(yǎng)至D(600 nm)=0.4，離心收集菌體，Trizol法提取總RNA并消化基因組DNA。取2 μg總RNA用特異性或隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將野生株基因組DNA梯度稀釋(至少5個(gè)梯度)制作各待測(cè)基因qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適當(dāng)稀釋后作為模板，用qRT-PCR檢測(cè)待測(cè)基因和內(nèi)參基因16 S mRNA水平。實(shí)驗(yàn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功制備glmY缺陷變異株

為制備glmY缺陷變異株，采用自殺質(zhì)粒同源重組的方法來(lái)敲除目的基因。以S. Typhi野生株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得glmY上、下游同源片段F1(423 bp)、F2(435 bp)，如圖1A。利用重疊PCR獲得F1+F2定向連接產(chǎn)物作為重組DNA片段(圖1B)，連接自殺質(zhì)粒，熱擊導(dǎo)入E.coliλ372感受態(tài)細(xì)胞。提取經(jīng)PCR及序列分析驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)入S. Typhi野生株中，用蔗糖誘導(dǎo)重組，PCR 擴(kuò)增glmY篩選菌株，最后獲得傳代穩(wěn)定的glmY缺失變異株(圖1C)。

M: DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；A：PCR擴(kuò)增同源片段；1，同源片段F1；2，同源片段F2；B：重疊PCR擴(kuò)增同源片段；1，陰性對(duì)照；2，F(xiàn)1+F2定向連接產(chǎn)物；C：PCR篩選重組菌株；S，陽(yáng)性對(duì)照；L，陰性對(duì)照；1～8，穩(wěn)定變異株的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 GlmY可增強(qiáng)傷寒沙門菌生物膜形成能力

結(jié)晶紫染色結(jié)果如圖2所示，與野生株相比，缺陷株的生物膜染色形成明顯降低(t=25.57，P<0.01)，表明GlmY缺失可減弱S. Typhi野生株的生物膜形成能力。

圖2 S. Typhi生物膜形成分析

2.3 GlmY影響生物膜相關(guān)基因表達(dá)水平

為進(jìn)一步探究GlmY通過(guò)何種調(diào)控途徑來(lái)影響生物膜形成，本研究選取11個(gè)生物膜形成要素的相關(guān)基因(菌毛：csgD、csgA、fimA；胞外多糖：yihP、rfaD、wcaA；鞭毛：flhD、fliA、fljB；纖維素：bcsA；表面蛋白：bapA)，并用qRT-PCR檢測(cè)野生株和缺陷株中上述基因的mRNA水平。如圖3所示，與野生株相比，缺陷株中csgD和csgA的mRNA水平明顯下降(P<0.01或<0.05)，同時(shí)缺陷株中胞外多糖相關(guān)基因yihP、rfaD、wcaA及纖維素相關(guān)基因bcsA的mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào)(P均<0.05或<0.01)，其余相關(guān)基因mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖3 野生株與glmY缺陷株生物膜形成相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

為探究在S. Typhi生物膜形成中具有調(diào)控作用的ncRNA，本課題組前期利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同狀態(tài)下的S. Typhi進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)生物膜狀態(tài)下的S. Typhi ncRNA GlmY表達(dá)水平較高。研究發(fā)現(xiàn)，ncRNA GlmY可協(xié)同ncRNA GlmZ促進(jìn)GlmS翻譯[9,12]。glmS基因編碼的谷氨酰胺合酶為細(xì)菌合成細(xì)胞壁主要成分N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸所必需。本研究在成功構(gòu)建glmY缺陷株基礎(chǔ)上進(jìn)行生物膜形成試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)glmY缺陷株生物膜形成能力明顯低于野生株。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)GlmY缺失可下調(diào)卷曲菌毛合成相關(guān)基因csgD和csgA的mRNA水平，但上調(diào)胞外多糖和纖維素合成相關(guān)基因的mRNA水平，推測(cè)GlmY對(duì)卷曲菌毛、胞外多糖及纖維素的合成均有調(diào)控作用，但以前者的作用為主。由此揭示GlmY有可能通過(guò)促進(jìn)S. Typhi的卷曲菌毛合成進(jìn)而調(diào)節(jié)生物膜形成。

已知卷曲菌毛是S. Typhi生物膜的主要蛋白成分[13]，CsgD作為卷曲菌毛合成中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，不僅負(fù)責(zé)調(diào)控csgBA操縱子(編碼主結(jié)構(gòu)蛋白CsgA和成核蛋白質(zhì)CsgB)和csgDEFG操縱子(編碼纖維組裝和分泌所需的蛋白質(zhì))的表達(dá)[14-15]，同時(shí)csgD轉(zhuǎn)錄本還是生物膜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信號(hào)樞紐，受到許多小的ncRNA調(diào)控。如OmrA，OmrB，McaS，RprA，GcvB等這些已知的小RNA均可通過(guò)與csgDmRNA直接結(jié)合或間接作用來(lái)促進(jìn)或者抑制csgD表達(dá)[16-18]。本研究雖然發(fā)現(xiàn)GlmY可下調(diào)csgD和csgA的mRNA水平，但并未確定二者是否為GlmY的新靶標(biāo)。此外，GlmY缺失后，有部分與生物膜形成相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)，其作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。