高鳳威，江夢穎，張欣怡，呂云瑋，姜戈晨，余宛君，劉爍，姚雪，蔣雅斕，陶澤華，邵啟祥，夏圣

(江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

巨噬細胞作為主要的固有免疫細胞之一，吞噬攝取抗原后對其進行加工、提呈，通過CD80、CD86等共刺激分子協(xié)同活化T細胞，啟動特異的適應性免疫應答[1-2]?；罨木奘杉毎€能夠產生一氧化氮、細胞因子(如TNF-α、IFN-β)等多種其他生物活性物質調節(jié)機體免疫應答，參與機體炎癥的發(fā)生發(fā)展[3]。由環(huán)鳥苷酸-腺苷酸(cGAMP)、cGAMP合酶、干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)等分子介導的cGAMP合酶-STING信號通路的活化是巨噬細胞參與機體免疫應答的關鍵機制之一[4-5]。當細胞胞質中出現(xiàn)異常雙鏈脫氧核糖核酸，cGAMP合酶-STING信號通路被激活，即可使胞內cGAMP增多，繼而位于內質網(wǎng)的STING磷酸化，并與TANK結合激酶1和干擾素調節(jié)因子3結合，從而使干擾素調節(jié)因子3發(fā)生磷酸化，最終促進Ⅰ型干擾素的分泌(如IFN-β)，調節(jié)機體免疫[6]。

黃芩苷是黃芩的主要活性組分之一，具有明顯的抗菌、抑制炎癥反應以及抗氧化等功能，對機體免疫反應有一定的調節(jié)作用[7]。已有文獻報道，經脂多糖介導誘導RAW264.7細胞活化后導致的炎性因子的分泌能夠被黃芩苷抑制[8]。而黃芩苷對小鼠骨髓源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)中cGAMP合酶-STING信號通路的影響仍不明確。本實驗將BMDMs作為研究對象，觀察黃芩苷處理后BMDMs細胞形態(tài)、細胞因子分泌水平及細胞表型的變化，探究黃芩苷在巨噬細胞STING通路活化中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6雄性小鼠(7～10周，No.201907363)，購于江蘇大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM(上海源培生物公司)；胎牛血清(德國Nobimpex公司)；12孔細胞培養(yǎng)板(德國Greiner Bio-One公司)；紅細胞裂解液(美國eBioscience公司)；黃芩苷(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；cGAMP、脂多糖、胰酶(美國Sigma-Aldrich公司)；巨噬細胞集落刺激因子(北京同立海源生物公司)；二甲基亞砜(國藥集團化學試劑有限公司)；一氧化氮試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；小鼠IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司)；小鼠IFN-β ELISA檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗小鼠CD11b-APC、抗小鼠 CD80-PE、抗小鼠 CD86-PE(美國eBioscience公司)；酶標儀(美國Rayto 公司)；生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 小鼠BMDMs的體外培養(yǎng)和細胞形態(tài)觀察

參照文獻[1]方法制備小鼠BMDM細胞。使用C57BL/6小鼠股骨和脛骨，常規(guī)制備C57BL/6小鼠骨髓單細胞懸液。經4℃、800 r/min離心5 min后，棄去上清液。加入800 μL紅細胞裂解液，靜置6～8 min后，800 r/min離心5 min，棄掉上清液后，PBS溶液洗2次，1 mL含10%胎牛血清、10 ng/mL 巨噬細胞集落刺激因子的DMEM重懸、計數(shù)。將2×106/mL的骨髓細胞接種于12孔板，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)誘導7 d，每2天進行半量換液。第7天時將細胞分為對照組、黃芩苷組、cGAMP組、黃芩苷+cGAMP組、脂多糖組、黃芩苷+脂多糖組，并向各處理組按需分別加入黃芩苷(150 μg/mL)、cGAMP(10 μg/mL)和脂多糖(1 μg/mL)。由于黃芩苷溶于DMSO，因此對照組中只加入等量的DMSO作為對照，黃芩苷組中只加入黃芩苷，cGAMP組中加入cGAMP和DMSO，黃芩苷+cGAMP組中加入黃芩苷和cGAMP，脂多糖組中加入脂多糖和DMSO，黃芩苷+脂多糖組中加入黃芩苷和脂多糖。繼續(xù)培養(yǎng)20～23 h后，用顯微鏡的低倍鏡觀察細胞分布狀況，高倍鏡觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)。

1.4 BMDMs表型的流式細胞術檢測

用胰酶消化、收集“1.3”中誘導培養(yǎng)后的各組BMDMs細胞，預冷PBS洗滌。用余液重懸細胞后，加抗小鼠CD11b-APC、抗小鼠CD80-PE或抗小鼠CD86-PE，4℃ 孵育25～30 min，加入2 mL預冷PBS，4℃、800 r/min離心5 min，棄去上清液，用250 μL的PBS重懸細胞后，流式細胞儀檢測各組CD11b陽性的群體中CD80、CD86表達水平。流式數(shù)據(jù)用Flowjo10.0軟件分析。

1.5 Griess法檢測一氧化氮

收集BMDMs培養(yǎng)上清液，按照試劑盒的操作流程檢測一氧化氮含量。反應后的顯色液于562 nm處檢測光密度(D)值。

1.6 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-6、TNF-α和IFN-β含量

收集細胞培養(yǎng)上清液，并依據(jù)各試劑盒說明書操作，反應后的顯色液于450 nm處檢測D值。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 5對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間的數(shù)據(jù)比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMDMs的細胞形態(tài)觀察

流式細胞術檢測結果顯示，經巨噬細胞集落刺激因子誘導的CD11b+BMDMs達97.9%(圖1)。圖2示各組BMDMs的鏡下形態(tài)呈圓形、橢圓形、梭形以及不規(guī)則形等。與對照組相比，經cGAMP或脂多糖活化的BMDMs出現(xiàn)較明顯聚集現(xiàn)象，其中以脂多糖處理的兩組中細胞尤為明顯。而黃芩苷對BMDMs活化前和活化后的生長狀態(tài)及形態(tài)均無明顯影響。

圖1 巨噬細胞集落刺激因子誘導后CD11b陽性BMDM細胞群體流式分析圖

圖2 顯微鏡下各處理組BMDMs細胞形態(tài)(×400)

2.2 黃芩苷對活化BMDMs細胞一氧化氮產生的影響

如圖3所示，與對照組相比，cGAMP組和脂多糖組BMDMs培養(yǎng)上清液中一氧化氮含量均升高(q=13.75，P<0.01；q=51.31，P<0.01)；脂多糖組一氧化氮含量顯著高于cGAMP組(q=37.56，P<0.01)。與cGAMP組相比，黃芩苷+cGAMP組一氧化氮含量明顯降低(q=13.75，P<0.01)；與脂多糖組相比，黃芩苷+脂多糖組一氧化氮含量亦明顯下降(q=27.45，P<0.01)。

2.3 黃芩苷對BMDMs 細胞CD80和CD86表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，黃芩苷組BMDMs表面CD80、CD86表達均降低(q=4.727，P<0.05；q=3.876，P<0.05)，cGAMP組的CD80和CD86表達均明顯升高(q=12.11，P<0.01；q=28.12，P<0.01)，脂多糖組CD80和CD86的表達亦明顯升高(q=46.07，P<0.01；q=21.20，P<0.01)。與cGAMP組比較，黃芩苷+cGAMP組CD80和CD86表達均降低(q=13.43，P<0.01；q=9.398，P<0.01)。相比脂多糖組，黃芩苷+脂多糖組CD80和CD86表達亦明顯降低(q=32.30，P<0.01；q=17.49，P<0.01)。

a: P<0.01,與對照組比較；b: P<0.01,與cGAMP組比較；c: P<0.01,與脂多糖組比較

a: P<0.05,b: P<0.01,與對照組比較；c: P<0.01,與cGAMP組比較；d: P<0.01,與脂多糖組比較

2.4 黃芩苷對BMDMs細胞分泌IL-6、TNF-α和IFN-β的影響

由圖5可知，與對照組相比，cGAMP組TNF-α (q=7.759，P<0.01)、IL-6 (q=77.81，P<0.01)和IFN-β(q=116.9，P<0.01)的分泌水平明顯增加；脂多糖組的TNF-α (q=34.71，P<0.01)、IL-6 (q=95.84，P<0.01)和IFN-β (q=10.64，P<0.01)的泌出量亦明顯升高。脂多糖組中IL-6 (q=18.03，P<0.01)和TNF-α (q=26.95，P<0.01)泌出量均明顯高于cGAMP組，而IFN-β的泌出量明顯低于cGAMP組 (q=106.2，P<0.01)。與cGAMP組相比，黃芩苷+cGAMP組IL-6(q=19.27，P<0.01)、TNF-α(q=3.704，P<0.05)和IFN-β(q=83.64，P<0.01)的分泌水平明顯降低。與脂多糖組相比，黃芩苷+脂多糖組中IL-6和TNF-α的分泌量無明顯變化，IFN-β的分泌水平則明顯降低(q=10.64，P<0.01)。

a: P<0.01,與對照組比較；b: P<0.01,c: P<0.05,與cGAMP組比較；d：P<0.01，與脂多糖組比較

3 討論

相關研究報道，黃芩苷能夠抑制核因子激活的B細胞的κ輕鏈增強子活化，抑制一氧化氮的產生和IL-6、TNF-α的分泌，改善脂多糖誘導的急性肺損傷和肝臟炎癥反應[9-11]。本研究結果顯示，cGAMP所介導的STING通路的活化和脂多糖的刺激均能促使巨噬細胞活化并產生一氧化氮，且黃芩苷能夠明顯抑制這兩條信號通路被激活后巨噬細胞中一氧化氮的產生。但是STING通路活化對一氧化氮產生的刺激作用較脂多糖的活化效果弱，這與相關報道結果一致[12]。

BMDM表面標志CD80、CD86的表達與巨噬細胞的活化程度密切相關，并參與協(xié)同抗原信號活化T淋巴細胞，從而介導固有免疫和獲得性免疫應答。結果表明，黃芩苷下調cGAMP和脂多糖所誘導的巨噬細胞表面CD80和CD86表達的上調效應，從而抑制巨噬細胞的活化，而且可能通過抑制這兩種表面分子的表達進而抑制巨噬細胞的抗原呈遞作用，從而抑制免疫應答。因此，黃芩苷對巨噬細胞STING通路活化后功能的調節(jié)作用尚需進一步研究。

炎癥因子也是巨噬細胞活化后分泌的重要免疫效應物。本研究結果表明，與脂多糖刺激作用比較，BMDMs中STING通路活化后TNF-α的分泌較少，IL-6分泌較多。而黃芩苷的處理能夠在一定程度抑制STING通路活化引起的TNF-α和IL-6泌出，但對于脂多糖的刺激作用所產生的這兩種細胞因子并無明顯影響。文獻報道黃芩苷能夠通過抑制巨噬細胞蛋白激酶B/核因子激活的B細胞的κ輕鏈增強子信號通路，從而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的分泌[10, 13]。與本研究結果的差異可能與其所用巨噬細胞類型不同有關，文獻中所用的是RAW264.7細胞系體外共培養(yǎng)或采用體內黃芩苷直接應用，而本研究體系則是使用BMDM進行體外實驗。

已有的文獻報道提示[14]，STING信號通路活化后主要能夠產生Ⅰ型干擾素從而發(fā)揮免疫學效應。本研究發(fā)現(xiàn)，用cGAMP活化BMDM的STING通路后，BMDM細胞的IFN-β分泌明顯增加，而脂多糖的刺激也會引起低水平IFN-β的產生。但黃芩苷可顯著抑制活化BMDMs的IFN-β分泌，尤其是對cGAMP活化組的抑制更明顯。綜上所述，黃芩苷可明顯抑制BMDM中STING通路活化，下調IFN-β等免疫效應分子的產生。本研究還只是對黃芩苷調控巨噬細胞通路的初步研究，其具體的調控機制還需要更詳盡的實驗探索。