趙康容，孫愛(ài)琴，林瓊，邵根寶

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首[1]，盡管早期診斷可以提高生存率，但僅有約15%患者能在早期獲得診斷[2]，絕大部分患者就診時(shí)就已經(jīng)處于晚期階段。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)能夠特異性催化組蛋白及非組蛋白等底物的對(duì)稱(chēng)性甲基化[3]，從而影響多個(gè)靶基因及多條信號(hào)通路，發(fā)揮眾多生物學(xué)功能[4-5]。研究表明，PRMT5在多種惡性腫瘤如淋巴瘤[6]、膠質(zhì)瘤[7]、乳腺癌[8]和白血病[9]等中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤惡化及患者預(yù)后相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PRMT5表達(dá)可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[10]。然而，PRMT5對(duì)卵巢癌細(xì)胞功能影響的具體機(jī)制仍不清楚。因此，本研究旨在探討PRMT5表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)之間的關(guān)系及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人卵巢癌HO8910細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存；多西環(huán)素(doxycycline，Dox)誘導(dǎo)型穩(wěn)定敲低PRMT5的HO8910細(xì)胞株用pLKO-Tet-puro慢病毒誘導(dǎo)型載體構(gòu)建，構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.1.2 主要試劑和儀器 骨架載體pLKO-Tet-On、pHR-CMV-8.2ΔVPR、pHR-CMV-VSVG以及pLKO-Tet-On-SC、pLKO-Tet-On-PRMT5、pCMV-Myc、pCMV- Myc-PRMT5質(zhì)粒由美國(guó)普渡大學(xué)胡長(zhǎng)燈教授惠贈(zèng)。兔抗人PRMT5多克隆抗體，兔抗人α-微管蛋白單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó) Bioworld 公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2)、波形蛋白、N-鈣黏蛋白和E-鈣黏蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；聚凝胺、Dox和嘌呤霉素(美國(guó) Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000試劑(美國(guó) Invitrogen公司)；熒光定量PCR試劑盒，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TaKaRa 公司)；PVDF膜和ECL顯影試劑(美國(guó)Millipore公司)。

核酸測(cè)定儀Biomate 3s(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Mx3000p Real Time PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Stratagene公司)；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Fluor Chem FC3(美國(guó)Protein Simple公司)；倒置顯微鏡BX51(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H08910細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合液的DMEM中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.2.2 PRMT5 shRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建 pLKO-PRMT5-shRNA質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pLKO-Tet-On-SC的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[12]。PRMT5-shRNA引物序列：上游5′-GCCCAGTTTGAGATGCCTTAT-3′，下游5′-CCCATCCTCTTCCCTATTAAG-3′。

1.2.3 HO8910細(xì)胞株中敲低PRMT5的效率驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)分為pLKO對(duì)照組(感染空載體慢病毒)、pLKO+Dox(100 ng/mL)組、shPRMT5組(感染PRMT5 shRNA 慢病毒)和shPRMT5+Dox(100 ng/mL)組；將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO8910細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，孵育12～24 h；換液加入3 mL DMEM和1 mL病毒液(2.0 μg pLKO-Tet-On-SC、2.0 μg pLKO-Tet-On-PRMT5)，混勻后加入8 μg/mL 聚凝胺感染細(xì)胞，孵育24 h；再重復(fù)上述步驟1次；用2.0 μg/mL 嘌呤霉素篩選72 h；再用含1.0 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，直至篩選出穩(wěn)定感染PRMT5- shRNA的HO8910細(xì)胞株(shPRMT5)；最后，用終質(zhì)量濃度為100 ng/mL Dox誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)和免疫印跡法分別檢測(cè)PRMT5 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 HO8910細(xì)胞株中PRMT5過(guò)表達(dá)的效率驗(yàn)證 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO8910細(xì)胞分為空白對(duì)照組(野生型HO8910細(xì)胞株)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pCMV-Myc質(zhì)粒)、實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-PRMT5質(zhì)粒)，接種于6 cm培養(yǎng)皿，孵育12 h；將2.0 μg pCMV-Myc-vector(對(duì)照)和2.0 μg pCMV-Myc-PRMT5質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HO8910細(xì)胞48 h；免疫印跡法用Myc檢測(cè)各組Myc-PRMT5表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞PRMT5mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 qRT-PCR法檢測(cè)PRMT5 mRNA表達(dá) 取“1.2.3”和“1.2.4”分組細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒操作手冊(cè)提取細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度法測(cè)定RNA純度和濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用熒光定量試劑盒進(jìn)一步行PCR擴(kuò)增。PRMT5基因(NM_001282953.1)引物序列：上游5′-GTTTGAAGAATGGGGAAGCCAAGTG-3′，下游5′-GAGCCAGAAAGGAAGTGTACTCC-3′；以GAPDH基因(NM 001256799.1)為內(nèi)參照，引物序列：上游5′-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3′，下游5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)PRMT5和EMT相關(guān)蛋白表達(dá) 收集穩(wěn)定敲低和順時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PRMT5的HO8910細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為shPRMT5+Dox組(誘導(dǎo)感染PRMT5 shRNA 慢病毒)、shPRMT5組(未誘感染PRMT shRNA慢病毒)、PCMV-Myc組(未過(guò)表達(dá)PRMT5)和pCMV-Myc-PRMT5組(過(guò)表達(dá)PRMT5的HO8910細(xì)胞株)，用預(yù)冷PBS 洗2次；加入 200 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，置于冰上處理 20 min；以12 000 r/min，4 ℃離心15 min；取上清液即為總蛋白。各取50 ng總蛋白用分離膠濃度為8%～12%的SDS-PAGE分離蛋白(80 V電壓30 min，110 V電壓100 min)；轉(zhuǎn)移至PVDF膜，300 mA恒流120～150 min；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；加入對(duì)應(yīng)一抗E-鈣黏蛋白、波形蛋白、N-鈣黏蛋白和MMP2，均1∶500，α-微管蛋白單克隆抗體(1 ∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜；次日，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；經(jīng)ECL顯影，用Image J軟件定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 按照參考文獻(xiàn)[13]，實(shí)驗(yàn)分組同“1.2.6”，將細(xì)胞制備成不含血清的細(xì)胞懸液，每個(gè)Transwell小室上室接種1.5×105個(gè)HO8910細(xì)胞，下室加入500 μL含血清的DMEM，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；用棉簽擦拭膜上表面未遷移的細(xì)胞，遷移至下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min；結(jié)晶紫染色液室溫染色15 min；顯微鏡觀察染色細(xì)胞。每個(gè)Transwell小室隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)染色細(xì)胞，相對(duì)遷移率=轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)/Transwell小室總細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)型穩(wěn)定敲低PRMT5的HO8910細(xì)胞株的效率驗(yàn)證

免疫印跡結(jié)果顯示，與shPRMT5對(duì)照組比較，shPRMT5+Dox組HO8910細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)顯著減少(t=4.927，P<0.05)；pLKO+Dox組PRMT5蛋白表達(dá)水平與pLKO對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.208，P>0.05)。qRT-PCR結(jié)果同樣顯示，shPRMT5+Dox組PRMT5 mRNA表達(dá)較pLKO對(duì)照組、pLKO+Dox組、shPRMT5組顯著減少(t=8.71，7.861，8.131，P均<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2 PRMT5過(guò)表達(dá)效率驗(yàn)證

免疫印跡結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均無(wú)標(biāo)簽蛋白Myc表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到Myc表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PRMT5 mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(t=39.547，37.813，P均<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3 PRMT5對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移的影響

Transwell結(jié)果顯示，與shPRM5對(duì)照組比較，shPRMT5+Dox實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移率顯著減少(t=4.157，P<0.05)；pCMV-Myc-PRMT5組中HO8910細(xì)胞遷移率顯著高于pCMV-Myc組(t=3.261，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 免疫印跡和qRT-PCR驗(yàn)證HO8910細(xì)胞中PRMT5基因敲低的效率

圖2 免疫印跡和qRT-PCR驗(yàn)證HO8910細(xì)胞中PRMT5基因過(guò)表達(dá)效率

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5過(guò)表達(dá)或敲低后細(xì)胞的遷移能力(結(jié)晶紫染色×200)

2.4 PRMT5敲低后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，與shPRMT5組相比，shPRMT5+Dox組HO8910細(xì)胞中PRMT5表達(dá)和間質(zhì)標(biāo)志分子MMP-2、波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01或<0.05)，而上皮標(biāo)志分子E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著增加(t=17.527，P<0.01)。見(jiàn)圖4。

1:shPRMT5組，2：shPRMT5+Dox組；a：P<0.05，b：P<0.01，與shPRMT5組比較

2.5 PRMT5過(guò)表達(dá)后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，與pCMV-Myc組相比,pCMV-Myc-PRMT5組HO8910細(xì)胞中Myc表達(dá)、MMP-2、波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01或<0.05)，而E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著降低(t=18.306，P<0.05)。見(jiàn)圖5。

1:pCMV-Myc組；2:pCMV-Myc-PRMT5組；a：P<0.05，b：P<0.01，與pCMV-Myc組比較

3 討論

EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，它賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程相關(guān)[14]。EMT表現(xiàn)為細(xì)胞黏附能力喪失，E-鈣黏蛋白表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物和纖維連接蛋白表達(dá)上升，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力增強(qiáng)。研究報(bào)道[15]，PRMT5協(xié)同MEP50/WDR77復(fù)合物通過(guò)表觀遺傳調(diào)控作用誘導(dǎo)EMT進(jìn)程，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移。本研究采用卵巢癌HO8910細(xì)胞株，通過(guò)免疫印跡法和Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)PRMT5促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，并增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。

細(xì)胞增殖與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本課題組前期發(fā)現(xiàn)[10]，PRMT5對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖有重要的調(diào)控作用，下調(diào)PRMT5可抑制HO8910細(xì)胞克隆形成，減低細(xì)胞DNA復(fù)制能力，并抑制細(xì)胞增殖；過(guò)表達(dá)PRMT5則相反，提示PRMT5可能作為一個(gè)潛在的致癌基因促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)PRMT5表達(dá)可以抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移，而過(guò)表達(dá)PRMT5則促進(jìn)細(xì)胞遷移。

E-鈣黏蛋白表達(dá)缺失或降低與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在小鼠模型中證實(shí)E-鈣黏蛋白缺失顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞侵入健康組織的能力[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低PRMT5可以促進(jìn)上皮標(biāo)志分子E-鈣黏蛋白表達(dá)，而PRMT5過(guò)表達(dá)則反之，由此表明PRMT5與細(xì)胞遷移密切相關(guān)。此外，外源表達(dá)PRMT5后，間質(zhì)標(biāo)志分子MMP-2、波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)HO8910細(xì)胞遷移，提示PRMT5可能通過(guò)EMT依賴的方式調(diào)控卵巢癌細(xì)胞遷移。

綜上，PRMT5在卵巢癌細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用，其可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的 EMT進(jìn)程及細(xì)胞遷移。然而，PRMT5對(duì)EMT轉(zhuǎn)化過(guò)程的調(diào)控作用是否與表觀遺傳修飾有關(guān)，以及在體內(nèi)卵巢腫瘤的轉(zhuǎn)移中是否有相同的作用仍需進(jìn)一步研究。