崔桂玲, 宋 艷, 胡曰富, 齊慶蓉

(四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

肼作為一種化學(xué)物質(zhì)，由于其堿性和還原性，使其在醫(yī)藥、化學(xué)、催化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，同時，肼也是一種高能量原料，所以也被應(yīng)用于航天領(lǐng)域，然而該物質(zhì)不僅有毒，還有致癌作用，微小量的泄露不僅會造成環(huán)境污染，也會對人體的肝、腎、肺、中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)等造成傷害[1-5]，因此對于微量肼的檢測至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的檢測肼的分析方法包括電化學(xué)分析法、色譜法和分光光度法，但這些分析方法不僅復(fù)雜耗時，而且靈敏度低[6-9]。相比于傳統(tǒng)的肼檢測方法，熒光分析法具有高靈敏性、高選擇性、操作簡便、成本低等優(yōu)點[10-12]，因此更受歡迎。文獻報道的主要檢測肼的基團有乙?；?-溴丁酸酯、乙酰丙酸鹽、鄰苯二甲酰亞胺、醛、丙二腈等，

Scheme 1

但大部分探針的最大紫外吸收和發(fā)射均位于紫外可見光區(qū)，不適合生物成像。因近紅外區(qū)的光具有較低的背景熒光，較低的光毒性和較深的穿透性[13-14]，所以近紅外熒光探針更具有應(yīng)用價值。

2016年，Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)了用乙酸酯作為識別位點的檢測肼的近紅外探針，2018年，Lu等[15]報道了用溴丁酸酯作為識別基團的檢測肼的近紅外探針，這類探針通過一個可以調(diào)控的羥基使探針及檢測肼后產(chǎn)物的最大發(fā)射波長均位于近紅外區(qū)，具有明顯的降低自熒光、低毒性、深度滲透等優(yōu)點，但兩者最大發(fā)射波長很接近，難以觀察到探針和產(chǎn)物各自熒光變化的線性。2012年，Lin等[16]報道在半花菁類分子(Chart 1)羥基的鄰位引入氯原子可以改變半花菁分子的部分光學(xué)性質(zhì)，但類似報道很少。鑒于此本文設(shè)計并合成了一個新型的檢測肼的熒光探針，并對其進行了光譜分析，研究其對肼的選擇性。以2,3,3-三甲基-3H-吲哚與正丙基溴為原料反應(yīng)合成2,3,3-三甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽2，繼而與2-氯-3-羥次甲基環(huán)己烯醛縮合生成2- (2-(2-氯-3-((3,3-二甲基-1-丙基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞烷基)亞乙基)-1-環(huán)己烯-1-)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽3，再與4-乙基間苯二酚在三乙胺催化下反應(yīng)生成2-(2-(7-乙基-6-羥基-2,3-二氫-1H-呫噸-4-)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽4，最后與乙酰氯經(jīng)成酯反應(yīng)生成半菁類探針2-(2-(7-乙基-6-乙酰氧基-2,3-二氫-1H-呫噸-4-)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚鹽5(Chart 2)，探針結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H NMR、13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450型紫外可見分光光度計；Varian-Unity 400 MHz型核磁共振儀；Waters Q-TOF-Premier型質(zhì)譜儀；Varian Cary Eclipse Fluoromete型熒光光譜儀。

Chart 1

Chart 2

其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)1的合成[17-18]

在干燥的500 mL三頸瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺37.2 g(0.5 mol)和二氯甲烷50 mL， 0 ℃下依次滴加三氯氧磷62.5 g(0.4 mol)，環(huán)己酮10.0 g(0.1 mol)， 80 ℃回流4 h；減壓蒸除溶劑，冷卻至室溫后傾至冰水中，析出大量黃色固體，抽濾，濾餅用冰水洗滌3次，真空干燥，丙酮重結(jié)晶后得黃色固體19.0 g，收率51%, m.p.127～128 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 10.84(s, 1H, CHO), 2.53～2.47(m, 1H, CH), 2.36(t,J=6.1 Hz, 4H, CH2), 1.58(p,J=6.3 Hz, 2H, CH2)。

(2)2的合成[17-19]

在干燥的250 mL三頸瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚5.0 g(31.5 mmol)、正丙基溴4.7 g(38.1 mmol)和鄰二氯苯15 mL，110 ℃攪拌12 h(TLC檢測)。冷卻至室溫，傾倒入100 mL異丙醚中，大量粘性固體析出，靜置，傾倒出上清液，加少量丙酮并攪拌，大量固體析出，抽濾，濾餅用異丙醚洗滌三次，得棕紅色固體產(chǎn)物24.5 g。該產(chǎn)品不經(jīng)純化直接用于下一步。

(3)3的合成[17-18]

在干燥的100 mL三頸瓶中加入24.5 g(6.0 mmol)、11.9 g(11.0 mmol)、乙酸鈉1.8 g(22.2 mmol)和乙酸酐8 mL，于室溫攪拌2 h，(TLC檢測)。加100 mL異丙醚，有大量綠色固體析出，抽濾，濾餅用異丙醚洗滌，得綠色固體產(chǎn)物36.9 g。該產(chǎn)品不經(jīng)純化直接用于下一步。

(4)4的合成[17]

在干燥的100 mL三頸瓶中加入3300.0 mg(49.6 mmol)、 4-乙基間苯二酚100.0 mg (72.4 mmol)、三乙胺270.0 mg(2668.2 mmol)和乙腈8 mL，回流5 h(TLC檢測)。冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=100/1～30/1，V/V)純化得青綠色固體4170.0 mg，收率68%;1H NMR(Methanol-d4, 400 MHz)δ: 8.15(d,J=13.4 Hz, 1H, CH=CH), 7.56(s, 1H, ArH), 7.30(d,J=7.4 Hz, 1H, ArH), 7.20(t,J=7.7 Hz, 1H, ArH), 7.17(s, 1H, ArH), 6.99(t,J=7.3 Hz, 1H, ArH), 6.95(d,J=8.0 Hz, 1H, ArH), 6.41(s, 1H, CH), 5.76(d,J=13.5 Hz, 1H, CH=CH), 3.82(t,J=7.4 Hz, 2H, CH2), 2.66(t,J=6.1 Hz, 2H, CH2), 2.57(t,J=6.7 Hz, 2H, CH2), 2.52(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 1.82(p,J=6.3 Hz, 2H, CH2), 1.72(p,J=7.4 Hz, 2H, CH2), 1.61(s, 6H, CH3), 1.13(t,J=7.5 Hz, 3H, CH3), 0.94(t,J=7.4 Hz, 3H, CH3); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C30H34NO2Br{[M-Br]+}440.2584, found 440.2578。

(5)5的合成[15-16]

在干燥的25 mL單頸瓶中加入421.9 mg(42.2 nmol)、三乙胺60.0 mg(59.3 nmol)和二氯甲烷25 mL，于冰鹽浴中攪拌，緩慢滴加乙酰氯110.0 mg(1.4 mmol)的二氯甲烷溶液2 mL，滴畢，室溫攪拌2 h(TLC檢測)。減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=100/1～30/1，V/V)純化得青綠色固體5150.0 mg，收率93%;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.61(d,J=14.9 Hz, 1H, CH=CH), 7.55～7.37 (m, 4H, ArH), 7.27(s, 1H, ArH), 7.15(s, 1H, ArH), 7.04(s, 1H, CH), 6.70(d,J=14.8 Hz, 1H, CH=CH), 4.58(t,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 2.80(t,J=6.1 Hz, 2H, CH2), 2.74(t,J=6.1 Hz, 2H, CH2), 2.58(q,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 2.39(s, 3H, CH3), 2.08～1.87(m, 4H, CH2), 1.79(s, 6H, CH3), 1.21(t,J=7.5 Hz, 3H, CH3), 1.08(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 178.30, 169.14, 160.27, 151.26, 150.81, 146.14, 142.00, 141.45, 133.86, 131.58, 130.17, 129.34, 127.76, 127.56, 122.52, 119.96, 115.40, 113.36, 109.96, 105.98, 50.91, 47.81, 29.49, 28.24, 24.56, 22.80, 21.59, 21.00, 20.26, 13.97, 11.59; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C32H36NO3Br{[M-Br]+}482.2690, found 482.2693。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜

用15% DMSO PBS溶液(pH=7.4)分別配制20 μmol/L的探針5標(biāo)準(zhǔn)溶液和2000 μmol/L的肼溶液，兩者等體積混合后，在避光條件下，每三分鐘取樣進行紫外掃描。由圖1a可知，探針5的最大紫外吸收波長為598 nm，與肼反應(yīng)后生成的產(chǎn)物最大紫外吸收波長為702 nm；由圖1b可知，探針與肼反應(yīng)60 min內(nèi)，探針最大紫外吸收值逐漸降低，產(chǎn)物最大紫外吸收值逐漸升高，隨著反應(yīng)時間的延長，598 nm處的最大紫外吸收值逐漸降低，702 nm處的最大紫外吸收值逐漸升高，且加肼前后混合液的顏色變化明顯，加肼之前為藍(lán)色，加肼反應(yīng)之后為青綠色，表明探針5能夠檢測肼；由圖1c可以看出，探針與肼的反應(yīng)時間隨著肼濃度的增大而加快。與肼反應(yīng)之前，探針5的羥基是以乙酸酯的形式存在，羥基氧原子給電子能力降低，最大紫外吸收波長較低，當(dāng)與肼反應(yīng)之后，產(chǎn)物主要以氧負(fù)離子的形式存在，氧原子給電子能力增強，故最大紫外吸收波長紅移[16]。

2.2 熒光發(fā)射光譜

用DMSO配制濃度為640 μmol/L探針標(biāo)準(zhǔn)溶液，用15%DMSO的PBS緩沖溶液(pH=7.4) 將探針5標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成20 μmol/L，分別與不同濃度的肼等體積混合反應(yīng)，得到熒光發(fā)射光譜(圖2c)。用598 nm進行激發(fā)，可得到探針5的最大發(fā)射波長為666 nm，與肼反應(yīng)之后，產(chǎn)物最大發(fā)射波長位于723 nm處(圖2a)，且產(chǎn)物的熒光強度隨著時間的延長大幅度增加，探針的熒光強度緩慢減小(圖2b)。

λ/nm

λ/nm

t/min

λ/nm

λ/nm

λ/nm圖2探針5的熒光發(fā)射光譜(a: 加肼前后的變化情況; b: 探針與不同濃度肼混合后在666 nm和723 nm處的熒光強度變化情況; c: 探針對不同濃度肼的熒光強度變化)

根據(jù)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移原理(PET)，當(dāng)探針5的識別基團乙?；幱谧杂蓱B(tài)時，其HOMO軌道上的電子可以向熒光團的HOMO轉(zhuǎn)移，致使熒光團被激發(fā)到LOMO軌道上的激發(fā)態(tài)電子不能返回基態(tài)產(chǎn)生熒光或熒光很弱，而乙酰基與肼結(jié)合之后，乙?；腍OMO上的電子無法轉(zhuǎn)移到熒光團的HOMO軌道上，使PET過程無法進行，這時熒光團的激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)產(chǎn)生熒光，故產(chǎn)物熒光遠(yuǎn)強于探針[20]。

2.3 選擇性評價

選擇性是評價探針的重要指標(biāo)之一，因此本實驗研究了探針5對可能的常見干擾物質(zhì) (2-羥基乙基胺、 KCl、 Na2SO4、 CaCl2、 MgSO4、 CuSO4、 ZnSO4、 FeCl3、 FeSO4、 NaBr、 CH3COONa、 K2CO3、 NaH2PO4、 NH4Cl、 NH3.H2O、二乙胺、尿素、硫脲、L-甘氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、異煙肼和乙酰肼)的響應(yīng)情況，分別向濃度為20 μmol/L的探針標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入等體積的2000 μmol/L的待測物質(zhì)溶液，室溫避光放置48 min后，依次取樣進行熒光掃描，結(jié)果表明，該探針5對上述物質(zhì)無明顯響應(yīng)，對肼具有良好的選擇性。

本文設(shè)計合成了一個可用于檢測肼的近紅外小分子熒光探針，通過可調(diào)控基團羥基，使探針5在與肼反應(yīng)前后共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起熒光強度的變化。探針5最大紫外吸收波長為598 nm，最大熒光發(fā)射波長為666 nm，與肼反應(yīng)后的產(chǎn)物最大紫外吸收波長為702 nm，最大熒光發(fā)射波長為723 nm，當(dāng)肼的濃度在0～1000 μmol/L時，熒光強度與濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9919，檢測限為2.93 μmol/L。同時，該探針的最大發(fā)射波長位于近紅外，有利于克服生物體自身熒光的干擾，有望成為一種理想的檢測肼的熒光探針。