徐 秦, 田嘉偉, 陳永正, 萬南微*

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué) a. 藥學(xué)院； b. 貴州省生物催化與手性藥物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； c. 貴州省綠色制藥工程研究中心，貴州 遵義 563000)

手性噁唑烷酮不僅是許多藥物和天然產(chǎn)物的核心骨架，而且是有機(jī)不對稱合成中的重要手性輔基[1]。手性噁唑烷酮的化學(xué)合成往往需要使用有毒試劑或危險(xiǎn)氣體，反應(yīng)條件苛刻，操作過程復(fù)雜[2-4]。生物催化反應(yīng)因其條件溫和，具有較高的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，在有機(jī)合成中的應(yīng)用越來越重要，尤其是手性化合物的制備[5]。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 7890A型氣相色譜儀。

氰酸鈉和2-異丙基環(huán)氧乙烷，Alfa Aesar公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

5-異丙基-2-噁唑烷酮消旋體2： 白色固體，產(chǎn)率43%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.21(s, 1H), 4.42～4.26(m, 1H), 3.58(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.39～3.22(m, 1H), 1.89(d,J=13.4, 1H), 1.01(d,J=6.7 Hz, 3H), 0.92(d,J=6.8 Hz, 3H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 160.6, 81.9, 44.0, 32.5, 17.7, 17.1。

1.3 生物轉(zhuǎn)化

重組鹵醇脫鹵酶的表達(dá)和粗酶液的制備參考文獻(xiàn)執(zhí)行[11-12]。鹵醇脫鹵酶的初步篩選，用粗酶液作催化劑，反應(yīng)條件如下：向10 mL反應(yīng)器中加入含1和NaOCN的PB溶液2 mL，鹵醇脫鹵酶粗酶液3 mL， 30 ℃和250 rpm條件下反應(yīng)6 h；反應(yīng)結(jié)束后，加入3 mL乙酸乙酯萃取，分離有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行手性氣相色譜分析。

鹵醇脫鹵酶HheA10和HheG整細(xì)胞反應(yīng)條件如下：在10 mL反應(yīng)器中，用5 mL緩沖溶液將收集的重組表達(dá)鹵醇脫鹵酶的大腸桿菌細(xì)胞重懸至一定細(xì)胞濃度；用DMSO作助溶劑，向體系中加入1母液后加入一定量的NaOCN，一定溫度下，250 rpm下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入3 mL乙酸乙酯萃取，分離有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行手性氣相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹵醇脫鹵酶的篩選

以1為底物，NaOCN為親核試劑，對11種鹵醇脫鹵酶催化劑進(jìn)行篩選，反應(yīng)結(jié)果如表1所示。HheA10具有較好的S立體選擇性，可以獲得92%ee和12%產(chǎn)率的2。鹵醇脫鹵酶HheA10對芳基鹵代醇的脫鹵反應(yīng)表現(xiàn)出較好的S立體選擇性[11]。此外，HheG表現(xiàn)出較好的R立體選擇性，可以獲得91%ee和9%產(chǎn)率的2。

表1 鹵醇脫鹵酶的篩選

Table 1 Screening of halohydrin dehalogenases

表1 鹵醇脫鹵酶的篩選

entry鹵醇脫鹵酶基因登錄號收率/%ee/%構(gòu)型1HheA5WP_0147435571524R2HhA10WP_0192011951292S3HheA11WP_020698933755R4HheB3EBL02020449S5HheB4EBP61646450S6HheCAAK92099224R7HheD9WP_0043558111150S8HheD10WP_0405060332310S9HheEEBP63112653S10HheE5WP_009577001556S11HheGWP_015443096991R

反應(yīng)條件：底物終濃度10 mM, NaOCN終濃度15 mM, 30 ℃, 250 rpm反應(yīng)6 h。

研究發(fā)現(xiàn)HheG對芳基取代的環(huán)氧化物表現(xiàn)出α-進(jìn)攻開環(huán)區(qū)域選擇性，但其拆分立體選擇性較差[13]。然而，HheG對脂肪族取代環(huán)氧化物1卻表現(xiàn)出β-進(jìn)攻開環(huán)區(qū)域選擇性和良好的立體選擇性。鹵醇脫鹵酶HheC和HheD10可以獲得22%和23%產(chǎn)率，但它們的立體選擇性較差。其他鹵醇脫鹵酶對1的動力學(xué)拆分均表現(xiàn)中等立體選擇性，獲得24%～56%ee的2。

2.2 (S)-2合成條件的考察

考察了鹵醇脫鹵酶HheA10催化1動力學(xué)拆分合成(S)-2的反應(yīng)條件。首先是對反應(yīng)pH、緩沖溶液和反應(yīng)溫度的研究，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)HheA10合成(S)-2的最佳反應(yīng)緩沖溶液為PB， pH 6.5。在此條件下，可以獲得19%產(chǎn)率和93%ee。以較低pH或偏堿性的緩沖溶液作為反應(yīng)溶劑時(shí)，HheA10的催化活性都有所下降，但對其立體選擇性影響不大。對不同反應(yīng)溫度考察發(fā)現(xiàn)，在35 ℃條件下可以獲得22%產(chǎn)率和91%ee的(S)-2，而其他較低或較高反應(yīng)溫度都引起了產(chǎn)率的降低，因此35 ℃為最適反應(yīng)溫度。

表2 反應(yīng)pH、緩沖液和反應(yīng)溫度對HheA10合成(S)-2的影響

Table 2 The influences of reaction pH/buffer and temperature on the HheA10-catalyzed formation of (S)-2

表2 反應(yīng)pH、緩沖液和反應(yīng)溫度對HheA10合成(S)-2的影響

entrypH緩沖液溫度/℃產(chǎn)率/%ee/%15.0NaAc-HAc30149126.0NaAc-HAc30169336.0PB30189246.5PB30199357.0PB30169368.0PB30148997.0Tris-H2SO4301592107.5Tris-H2SO4301692118.0Tris-H2SO4301491126.5PB201087136.5PB251391146.5PB352291156.5PB451087

反應(yīng)條件：細(xì)胞濃度10 g cdw·L-1, 底物濃度10 mM, NaOCN濃度15 mM, 30 ℃, 250 rpm反應(yīng)6 h。

對NaOCN當(dāng)量比和生物催化劑添加量(細(xì)胞濃度)進(jìn)行了考察，結(jié)果如表3所示， NaOCN當(dāng)量比減少時(shí)，產(chǎn)率降低，表明該反應(yīng)速率下降。隨著當(dāng)量比增加，產(chǎn)率隨之增加；在當(dāng)量比為在6/1時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大值40%，繼續(xù)增加當(dāng)量比并未獲得更高的產(chǎn)率。此外，增加當(dāng)量比并未導(dǎo)致產(chǎn)物ee降低，表明鹵醇脫鹵酶HheA10具有較好的立體選擇性。因此，確定該反應(yīng)NaOCN的當(dāng)量比為6/1。通過對不同細(xì)胞濃度研究發(fā)現(xiàn)，降低細(xì)胞濃度至5 g cdw·L-1，產(chǎn)率明顯下降；增加細(xì)胞濃度至15 g cdw·L-1時(shí)，可以獲得44%產(chǎn)率和93%ee；繼續(xù)增加細(xì)胞濃度至20 g cdw·L-1時(shí)，產(chǎn)率略有增加，但ee值也有所下降。綜合考慮產(chǎn)物2的產(chǎn)率和ee，確定最優(yōu)的催化劑用量為15 g cdw·L-1。

表3 當(dāng)量比與細(xì)胞濃度對HheA10合成(S)-2的影響

Table 3 The influences of ration and cell density on the HheA10-catalyzed formation of (S)-2

表3 當(dāng)量比與細(xì)胞濃度對HheA10合成(S)-2的影響

entryratio(NaOCN/1)細(xì)胞濃度/g cdw·L-1產(chǎn)率/%ee/%10.5/110108521/110179131.5/110229243/110269256/110409168/110409276/15279286/115449396/1204891

反應(yīng)條件：PB (pH 6.5)反應(yīng)緩沖液，底物濃度10 Mm, 35 ℃, 250 rpm反應(yīng)6 h。

在確定最優(yōu)反應(yīng)條件后，對不同底物濃度的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行了考察，分別在6、 12和24 h對反應(yīng)進(jìn)行取樣檢測，研究結(jié)果如圖1所示，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?～20 mM時(shí)，HheA10催化獲得(S)-2的產(chǎn)率在50%左右，立體選擇性保持在92%左右。當(dāng)繼續(xù)增加底物濃度至30 mM時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率下降至40%左右，延長反應(yīng)時(shí)間并未使產(chǎn)率得到明顯提高。此外，反應(yīng)的立體選擇性有略微的下降；在反應(yīng)24 h時(shí)，得(S)-2的ee為87%。進(jìn)一步增加底物濃度至50 mM時(shí)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物2的產(chǎn)率和ee都有明顯的下降；在反應(yīng)24 h時(shí)，得(S)-2的產(chǎn)率為22%，ee為80%。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^30 mM時(shí)，會影響HheA10催化合成手性(S)-2的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。

mM

mM

2.3 (R)-5-異丙基-2-噁唑烷酮合成條件的考察

對HheG催化合成4-芳基取代噁唑烷酮的反應(yīng)pH、緩沖溶液、反應(yīng)溫度、NaOCN當(dāng)量比和細(xì)胞濃度進(jìn)行考察后[13]，針對HheG催化1合成手性(R)-2的最優(yōu)條件直接參考前期的研究結(jié)果：PB緩沖液，pH 7.5， 30 ℃， NaOCN當(dāng)量比3/1，細(xì)胞濃度為10 g cdw·L-1。在此基礎(chǔ)之上，重點(diǎn)研究了HheG催化不同底物濃度1合成(R)-2的反應(yīng)進(jìn)程。同樣在6、 12和24 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對反應(yīng)進(jìn)行取樣檢測，研究結(jié)果如圖2所示，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?～10 mM時(shí)，HheG可以催化獲得(R)-2的產(chǎn)率在40%左右，立體選擇性保持在90%左右。當(dāng)繼續(xù)增加底物濃度至20 mM時(shí)，我們可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率下降至30%左右，反應(yīng)的立體選擇性基本保持。當(dāng)進(jìn)一步增加底物濃度至30和50 mM時(shí)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率明顯下降，在反應(yīng)24 h時(shí)的產(chǎn)率均為25%左右。此外，在30和50 mM底物濃度下，HheA10立體選擇性性也有略微下降，反應(yīng)24 h時(shí)，獲得(R)-2的ee分別為87%和84%。結(jié)果表明，較高的底物濃度同樣會影響HheG催化合成(R)-2的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。但與HheA10催化合成(S)-2的反應(yīng)相比，該反應(yīng)的立體選擇性受底物濃度影響較小，宜在低于20 mM底物濃度下進(jìn)行。

以2-異丙基環(huán)氧乙烷為底物，通過酶的篩選獲得可以分別立體選擇性合成(S)-5-異丙基-2-噁唑烷酮的鹵醇脫鹵酶HheA10，以及可立體選擇性合成(R)-5-異丙基-2-噁唑烷酮的鹵醇脫鹵酶HheG。兩種鹵醇脫鹵酶均表現(xiàn)出較好的催化活性和立體選擇性，為手性5-異丙基-2-噁唑烷酮的合成提供了立體選擇性互補(bǔ)的生物催化劑。