徐 秦, 田嘉偉, 陳永正, 萬南微*

(1. 遵義醫(yī)科大學 a. 藥學院； b. 貴州省生物催化與手性藥物合成重點實驗室； c. 貴州省綠色制藥工程研究中心，貴州 遵義 563000)

手性噁唑烷酮不僅是許多藥物和天然產(chǎn)物的核心骨架，而且是有機不對稱合成中的重要手性輔基[1]。手性噁唑烷酮的化學合成往往需要使用有毒試劑或危險氣體，反應條件苛刻，操作過程復雜[2-4]。生物催化反應因其條件溫和，具有較高的化學、區(qū)域和立體選擇性，在有機合成中的應用越來越重要，尤其是手性化合物的制備[5]。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標)；Agilent 7890A型氣相色譜儀。

氰酸鈉和2-異丙基環(huán)氧乙烷，Alfa Aesar公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

5-異丙基-2-噁唑烷酮消旋體2： 白色固體，產(chǎn)率43%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.21(s, 1H), 4.42～4.26(m, 1H), 3.58(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.39～3.22(m, 1H), 1.89(d,J=13.4, 1H), 1.01(d,J=6.7 Hz, 3H), 0.92(d,J=6.8 Hz, 3H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 160.6, 81.9, 44.0, 32.5, 17.7, 17.1。

1.3 生物轉(zhuǎn)化

重組鹵醇脫鹵酶的表達和粗酶液的制備參考文獻執(zhí)行[11-12]。鹵醇脫鹵酶的初步篩選，用粗酶液作催化劑，反應條件如下：向10 mL反應器中加入含1和NaOCN的PB溶液2 mL，鹵醇脫鹵酶粗酶液3 mL， 30 ℃和250 rpm條件下反應6 h；反應結(jié)束后，加入3 mL乙酸乙酯萃取，分離有機相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后進行手性氣相色譜分析。

鹵醇脫鹵酶HheA10和HheG整細胞反應條件如下：在10 mL反應器中，用5 mL緩沖溶液將收集的重組表達鹵醇脫鹵酶的大腸桿菌細胞重懸至一定細胞濃度；用DMSO作助溶劑，向體系中加入1母液后加入一定量的NaOCN，一定溫度下，250 rpm下反應，反應結(jié)束后，加入3 mL乙酸乙酯萃取，分離有機相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后進行手性氣相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹵醇脫鹵酶的篩選

以1為底物，NaOCN為親核試劑，對11種鹵醇脫鹵酶催化劑進行篩選，反應結(jié)果如表1所示。HheA10具有較好的S立體選擇性，可以獲得92%ee和12%產(chǎn)率的2。鹵醇脫鹵酶HheA10對芳基鹵代醇的脫鹵反應表現(xiàn)出較好的S立體選擇性[11]。此外，HheG表現(xiàn)出較好的R立體選擇性，可以獲得91%ee和9%產(chǎn)率的2。

表1 鹵醇脫鹵酶的篩選

Table 1 Screening of halohydrin dehalogenases

表1 鹵醇脫鹵酶的篩選

entry鹵醇脫鹵酶基因登錄號收率/%ee/%構(gòu)型1HheA5WP_0147435571524R2HhA10WP_0192011951292S3HheA11WP_020698933755R4HheB3EBL02020449S5HheB4EBP61646450S6HheCAAK92099224R7HheD9WP_0043558111150S8HheD10WP_0405060332310S9HheEEBP63112653S10HheE5WP_009577001556S11HheGWP_015443096991R

反應條件：底物終濃度10 mM, NaOCN終濃度15 mM, 30 ℃, 250 rpm反應6 h。

研究發(fā)現(xiàn)HheG對芳基取代的環(huán)氧化物表現(xiàn)出α-進攻開環(huán)區(qū)域選擇性，但其拆分立體選擇性較差[13]。然而，HheG對脂肪族取代環(huán)氧化物1卻表現(xiàn)出β-進攻開環(huán)區(qū)域選擇性和良好的立體選擇性。鹵醇脫鹵酶HheC和HheD10可以獲得22%和23%產(chǎn)率，但它們的立體選擇性較差。其他鹵醇脫鹵酶對1的動力學拆分均表現(xiàn)中等立體選擇性，獲得24%～56%ee的2。

2.2 (S)-2合成條件的考察

考察了鹵醇脫鹵酶HheA10催化1動力學拆分合成(S)-2的反應條件。首先是對反應pH、緩沖溶液和反應溫度的研究，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)HheA10合成(S)-2的最佳反應緩沖溶液為PB， pH 6.5。在此條件下，可以獲得19%產(chǎn)率和93%ee。以較低pH或偏堿性的緩沖溶液作為反應溶劑時，HheA10的催化活性都有所下降，但對其立體選擇性影響不大。對不同反應溫度考察發(fā)現(xiàn)，在35 ℃條件下可以獲得22%產(chǎn)率和91%ee的(S)-2，而其他較低或較高反應溫度都引起了產(chǎn)率的降低，因此35 ℃為最適反應溫度。

表2 反應pH、緩沖液和反應溫度對HheA10合成(S)-2的影響

Table 2 The influences of reaction pH/buffer and temperature on the HheA10-catalyzed formation of (S)-2

表2 反應pH、緩沖液和反應溫度對HheA10合成(S)-2的影響

entrypH緩沖液溫度/℃產(chǎn)率/%ee/%15.0NaAc-HAc30149126.0NaAc-HAc30169336.0PB30189246.5PB30199357.0PB30169368.0PB30148997.0Tris-H2SO4301592107.5Tris-H2SO4301692118.0Tris-H2SO4301491126.5PB201087136.5PB251391146.5PB352291156.5PB451087

反應條件：細胞濃度10 g cdw·L-1, 底物濃度10 mM, NaOCN濃度15 mM, 30 ℃, 250 rpm反應6 h。

對NaOCN當量比和生物催化劑添加量(細胞濃度)進行了考察，結(jié)果如表3所示， NaOCN當量比減少時，產(chǎn)率降低，表明該反應速率下降。隨著當量比增加，產(chǎn)率隨之增加；在當量比為在6/1時，產(chǎn)率達到最大值40%，繼續(xù)增加當量比并未獲得更高的產(chǎn)率。此外，增加當量比并未導致產(chǎn)物ee降低，表明鹵醇脫鹵酶HheA10具有較好的立體選擇性。因此，確定該反應NaOCN的當量比為6/1。通過對不同細胞濃度研究發(fā)現(xiàn)，降低細胞濃度至5 g cdw·L-1，產(chǎn)率明顯下降；增加細胞濃度至15 g cdw·L-1時，可以獲得44%產(chǎn)率和93%ee；繼續(xù)增加細胞濃度至20 g cdw·L-1時，產(chǎn)率略有增加，但ee值也有所下降。綜合考慮產(chǎn)物2的產(chǎn)率和ee，確定最優(yōu)的催化劑用量為15 g cdw·L-1。

表3 當量比與細胞濃度對HheA10合成(S)-2的影響

Table 3 The influences of ration and cell density on the HheA10-catalyzed formation of (S)-2

表3 當量比與細胞濃度對HheA10合成(S)-2的影響

entryratio(NaOCN/1)細胞濃度/g cdw·L-1產(chǎn)率/%ee/%10.5/110108521/110179131.5/110229243/110269256/110409168/110409276/15279286/115449396/1204891

反應條件：PB (pH 6.5)反應緩沖液，底物濃度10 Mm, 35 ℃, 250 rpm反應6 h。

在確定最優(yōu)反應條件后，對不同底物濃度的生物轉(zhuǎn)化反應進程進行了考察，分別在6、 12和24 h對反應進行取樣檢測，研究結(jié)果如圖1所示，當?shù)孜餄舛仍?～20 mM時，HheA10催化獲得(S)-2的產(chǎn)率在50%左右，立體選擇性保持在92%左右。當繼續(xù)增加底物濃度至30 mM時，可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率下降至40%左右，延長反應時間并未使產(chǎn)率得到明顯提高。此外，反應的立體選擇性有略微的下降；在反應24 h時，得(S)-2的ee為87%。進一步增加底物濃度至50 mM時，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物2的產(chǎn)率和ee都有明顯的下降；在反應24 h時，得(S)-2的產(chǎn)率為22%，ee為80%。結(jié)果表明，當?shù)孜餄舛瘸^30 mM時，會影響HheA10催化合成手性(S)-2的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。

mM

mM

2.3 (R)-5-異丙基-2-噁唑烷酮合成條件的考察

對HheG催化合成4-芳基取代噁唑烷酮的反應pH、緩沖溶液、反應溫度、NaOCN當量比和細胞濃度進行考察后[13]，針對HheG催化1合成手性(R)-2的最優(yōu)條件直接參考前期的研究結(jié)果：PB緩沖液，pH 7.5， 30 ℃， NaOCN當量比3/1，細胞濃度為10 g cdw·L-1。在此基礎之上，重點研究了HheG催化不同底物濃度1合成(R)-2的反應進程。同樣在6、 12和24 h 3個時間點對反應進行取樣檢測，研究結(jié)果如圖2所示，當?shù)孜餄舛仍?～10 mM時，HheG可以催化獲得(R)-2的產(chǎn)率在40%左右，立體選擇性保持在90%左右。當繼續(xù)增加底物濃度至20 mM時，我們可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率下降至30%左右，反應的立體選擇性基本保持。當進一步增加底物濃度至30和50 mM時，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率明顯下降，在反應24 h時的產(chǎn)率均為25%左右。此外，在30和50 mM底物濃度下，HheA10立體選擇性性也有略微下降，反應24 h時，獲得(R)-2的ee分別為87%和84%。結(jié)果表明，較高的底物濃度同樣會影響HheG催化合成(R)-2的反應轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。但與HheA10催化合成(S)-2的反應相比，該反應的立體選擇性受底物濃度影響較小，宜在低于20 mM底物濃度下進行。

以2-異丙基環(huán)氧乙烷為底物，通過酶的篩選獲得可以分別立體選擇性合成(S)-5-異丙基-2-噁唑烷酮的鹵醇脫鹵酶HheA10，以及可立體選擇性合成(R)-5-異丙基-2-噁唑烷酮的鹵醇脫鹵酶HheG。兩種鹵醇脫鹵酶均表現(xiàn)出較好的催化活性和立體選擇性，為手性5-異丙基-2-噁唑烷酮的合成提供了立體選擇性互補的生物催化劑。