周嬪 徐偉銘 葉恩如 張玲娜

特殊染色已經(jīng)開展了100多年，常用于顯示在HE染色中難以觀察或觀察不到的組織成分（如結(jié)核桿菌、真菌、網(wǎng)狀纖維等），是臨床病理診斷重要的輔助技術(shù)。特殊染色過程復(fù)雜，影響因素多，設(shè)立合適的陽性對(duì)照是特殊染色質(zhì)量控制的關(guān)鍵。歸檔人體組織蠟塊是特殊染色最常用的陽性對(duì)照，但存在與檢測(cè)組織混淆的可能，尤其是切片外借會(huì)診時(shí)，有可能誤判。目前給每例特殊染色設(shè)立陽性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)室不多。筆者嘗試用市售高活性酵母菌和蛋清的混合團(tuán)塊制成蠟塊，用于作為顯示真菌的特殊染色的新型陽性對(duì)照。以常用過碘酸希夫染色（PAS染色）和六胺銀染色為例，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 珠海貝索生物技術(shù)有限公司PAS染色、六胺銀染色試劑盒，日本櫻花全封閉組織脫水機(jī)VRP-6，日本櫻花組織包埋機(jī)，德國萊卡石蠟切片機(jī)。

1.2 對(duì)照蠟塊制作

1.2.1 活性酵母菌備用 市售安琪高活性干酵母菌0.05 g，溶于1 ml溫蒸餾水中。

1.2.2 制備蛋清基質(zhì) 取1只新鮮雞蛋或鵪鶉蛋，用一次性吸管吸出蛋清置于燒杯中，攪拌均勻，包上保鮮膜，冰箱冷藏備用。

1.2.3 酵母菌蛋清混合團(tuán)塊制備 在酵母菌溶液中滴加200～300倍體積的蛋清，用震蕩器混勻。沿離心管管壁緩緩加入95%乙醇溶液40 ml，靜置30 min，2 500 r/min離心5 min，倒去上清液，沿離心管管壁緩緩加入10%中性甲醛溶液 40 ml，固定 6～8 h，2 500 r/min 離心 5 min，倒去上清液，留沉淀物備用。

1.2.4 組織脫水包埋 將酵母菌蛋清混合團(tuán)塊用胃鏡紙包好，裝入包埋盒中，在脫水機(jī)中脫水，透明，浸蠟。在自動(dòng)包埋機(jī)操作臺(tái)打開包埋盒，用鑷子將酵母菌蛋清混合團(tuán)塊夾均。在小號(hào)鐵皮模具里加少量石蠟，置于加熱臺(tái)上，用鑷子夾取適量酵母菌蛋清混合團(tuán)塊放進(jìn)模具里攪拌均勻，將模具蓋上包埋盒，再加入適量石蠟后轉(zhuǎn)移至凍臺(tái)稍冷卻，將蠟塊倒扣，輕敲脫模。

1.2.5 制作對(duì)照切片 用石蠟切片機(jī)將陽性對(duì)照蠟塊按3 μm厚度連續(xù)切片，將切片移至攤片機(jī)中。對(duì)照切片貼于載玻片右側(cè)，置于染色架上晾干，儲(chǔ)存于干燥切片盒內(nèi)備用。將切好的檢測(cè)組織統(tǒng)一貼在對(duì)照切片的左側(cè)，放入60℃烤箱中烤片過夜。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PAS染色 切片脫蠟至蒸餾水，1%高碘酸滴染10 min，蒸餾水沖洗，擦干組織周邊水分，將切片置于濕盒中，PAS染液滴染15 min，流水洗10 min，Mayer蘇木素復(fù)染1 min，水洗，藍(lán)化，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.2 六胺銀染色 切片脫蠟至蒸餾水，1%高碘酸氧化15 min，蒸餾水沖洗2 min，六胺銀染液（臨用前配制，水浴箱預(yù)熱15 min）于62℃水浴箱內(nèi)浸染30 min左右（鏡下控制染色情況），蒸餾水洗，0.2%氯化金溶液滴染30 s，水洗，5%硫代硫酸鈉滴染3 min，水洗，伊紅復(fù)染30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結(jié)果

將新型陽性對(duì)照應(yīng)用于本科室2019年9至12月120例肉芽腫組織特殊染色，新型陽性對(duì)照染色結(jié)果準(zhǔn)確，菌體分布合理，背景干凈清晰，極易鑒別，加快了病理醫(yī)生閱片時(shí)對(duì)特殊染色質(zhì)量的評(píng)估。對(duì)比圖1-2發(fā)現(xiàn)檢測(cè)組織和陽性對(duì)照的陽性菌染色鮮艷程度接近。預(yù)切的對(duì)照玻片連續(xù)使用3個(gè)月，染色結(jié)果一直穩(wěn)定可靠，未出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。

圖1 過碘酸希夫染色（PAS染色）所見（a：檢測(cè)組織PAS染色，新型隱球菌莢膜呈亮麗的紫紅色，背景干擾因素多；b：新型對(duì)照組織PAS染色，酵母菌呈圓形或類圓形，紫紅色，背景清晰；PAS染色，×400）

圖2 六胺銀染色所見（a：檢測(cè)組織六胺銀染色，新型隱球菌莢膜呈黑褐色，背景較清晰；b：新型對(duì)照組織六胺銀染色，酵母菌呈黑褐色，背景清晰；六胺銀染色，×400）

3 討論

隨著近年來各種高效廣譜抗生素、免疫抑制劑及抗惡性腫瘤藥物的廣泛使用，再加上器官移植、導(dǎo)管技術(shù)以及外科其他介入性治療的全面成熟與發(fā)展，導(dǎo)致因條件致病性真菌所引起的系統(tǒng)性真菌感染日益增多[1]。由于真菌在組織中用HE染色一般著色較淺或不著色，觀察比較困難，尤其是在真菌數(shù)量較少或菌體較小的情況下更難辨認(rèn)。只有當(dāng)真菌數(shù)量多到一定程度時(shí)常規(guī)HE染色才比較容易鑒別，故漏診概率很大[2]。此外即便HE染色切片中有時(shí)即可見真菌，還需進(jìn)行特殊染色如六胺銀染色、PAS染色以明確診斷[3]。

有時(shí)染色結(jié)果與臨床考慮不一致時(shí)，醫(yī)師常常懷疑特殊染色步驟是否正確，染色試劑是否可靠，因此在檢測(cè)組織旁設(shè)置陽性對(duì)照可以證明染色結(jié)果的可靠性。筆者通過反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蛋清既能凝聚酵母菌又能稀釋酵母菌，還能增加對(duì)照組織與玻片的親和力，避免脫片，是一個(gè)良好的添加劑。陽性對(duì)照以400×視野下見50個(gè)左右陽性菌為佳，既方便查對(duì)又避免細(xì)菌堆疊。隨機(jī)對(duì)比30例檢測(cè)組織和對(duì)照組織，兩者陽性菌染色鮮艷程度接近。

新型陽性對(duì)照具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）檢測(cè)組織與對(duì)照組織在同一玻片上，保證檢測(cè)條件的一致性。（2）避免歸檔蠟塊的消耗。人體深部肉芽腫多數(shù)采用細(xì)針穿刺組織進(jìn)行病理檢測(cè)，組織量少，應(yīng)盡可能保存組織，以便后期可以進(jìn)一步檢測(cè)。（3）制作簡便、來源廣泛。市售高活性干酵母菌和蛋清等都是生活常用品，容易獲得。（4）結(jié)果穩(wěn)定，有效期長。預(yù)切一批對(duì)照玻片，使用3個(gè)月，染色結(jié)果持續(xù)穩(wěn)定。對(duì)照蠟塊可存放數(shù)年。（5）對(duì)照組織占位?。? mm×5 mm），且無結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，與檢測(cè)組織界限清楚，不易混淆，鏡下陽性菌分布均勻，數(shù)量適中，染色和形態(tài)結(jié)構(gòu)典型，方便閱片和查對(duì)。

綜上所述，用酵母菌和蛋清制作的新型陽性對(duì)照優(yōu)點(diǎn)較多，值得推廣。