王 琦，王曉秋，顧 萍，李傳應(yīng)

隱球菌廣泛存在于土壤、鴿糞和樹洞中，為條件致病菌[1]。隨著HIV感染、抗生素以及免疫抑制劑使用的增加，隱球菌感染逐漸增多。該病主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺臟，其次是皮膚、腎臟等，起病隱匿，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，易誤、漏診[2-4]。隱球菌感染的治療與早期正確的診斷密切相關(guān)。近年熒光染色在真菌感染的檢測中應(yīng)用越來越多，但多集中在淺部真菌或體液等新鮮樣本的涂片檢測[5-6]，在石蠟包埋組織中的應(yīng)用卻鮮有報道。本文收集12例病理診斷的隱球菌病，探索熒光染色在石蠟包埋組織中檢測隱球菌的潛在應(yīng)用價值，并和特殊染色做比較，以期找出效果最佳的隱球菌顯色方法。

1 材料與方法

1.1 材料選取2017～2019年中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院存檔的隱球菌感染標(biāo)本12例，其中肺部感染9例，皮膚感染2例，鼻腔感染1例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃烤片1～2 h。

1.2 方法

1.2.1HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分化，水洗，伊紅染色30 s，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.2熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，添加一滴真菌熒光染色液覆蓋于標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，使其與標(biāo)本充分結(jié)合。染色1～2 min，用濾紙吸取玻片周邊多余染液，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3PAS染色 切片脫蠟至水，高碘酸氧化10 min，水洗，Schiff試劑染色10～15 min，流水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.4六胺銀染色 配制六胺銀工作液：將5滴5%的硝酸銀緩慢加入5 mL 3%的烏洛托品溶液中，邊加邊搖，至白色沉淀溶解，然后加入2 mL 5%的四硼酸鈉溶液，最后加入25 mL蒸餾水，混勻待用。六胺銀染色步驟：切片脫蠟至水，高碘酸氧化10 min，水洗后放入工作液中，65 ℃烤箱染色40～60 min，期間經(jīng)多次顯微鏡下觀察，0.2%氯化金調(diào)色，硫代硫酸鈉固定2 min，伊紅復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

2 結(jié)果

4種方法均能染出隱球菌。HE染色：隱球菌呈現(xiàn)隱約的淡紅或淡藍色，有時不著色，輪廓不明顯，圓形或橢圓形，不易觀察(圖1)。熒光染色：隱球菌菌壁呈亮藍色，背景藍黑色，隱球菌結(jié)構(gòu)清晰，反差明顯(圖2)，染色48 h后，菌壁亮藍色減弱(圖3)。PAS染色：隱球菌菌體中間淡染，菌壁呈紫紅色，細胞核顯藍色，背景淡紅色至紅色，反差較弱(圖4)。六胺銀染色：隱球菌呈黑褐色，菌壁四周深黑色，中間為淡染區(qū)，用伊紅復(fù)染時，背景為紅色(圖5)。

3 討論

隱球菌為酵母型真菌，圓形或橢圓形，直徑3～20 μm，菌體周圍被一厚3～5 μm的強折光性莢膜包繞，由黏多糖物質(zhì)組成。近年隱球菌感染越來越多，明確診斷對隱球菌病的治療有重要的指導(dǎo)作用。但是該病臨床表現(xiàn)各異，缺乏特征性的影像學(xué)表現(xiàn)，診斷具有一定的挑戰(zhàn)性[2-4]。

組織病理學(xué)檢查是診斷隱球菌感染的重要手段，在病變組織中查見隱球菌病原體便可確診。常規(guī)HE染色有時僅顯示病灶內(nèi)隱球菌呈淡紅、淡藍或不顯色的圓形空泡狀小體，若醫(yī)師經(jīng)驗少或觀察不仔細，易漏診，常需借助特殊染色進行檢測。PAS染色和六胺銀染色是常用的顯示隱球菌的特殊染色方法。兩種染色均是利用氧化劑氧化隱球菌菌壁的多糖，暴露出醛基，再分別與Schiff試劑或銀離子發(fā)生反應(yīng)，使菌壁呈現(xiàn)出相應(yīng)的紫紅色或黑色。然而，這兩種染色方法對于所有的真菌孢子均為陽性反應(yīng)，特異性較差。

真菌熒光染色液是熒光增白劑和氫氧化鉀的混合溶液，熒光增白劑是一種染料，能夠與真菌細胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素特異性結(jié)合而使菌體著色，在波長為340～380 nm的紫外光照射下，會發(fā)出亮藍色的熒光[7]。熒光染液中的KOH成分不僅可以溶解組織細胞、角蛋白和脂肪等組織碎屑，使組織透明化，還可以去除背景中的干擾熒光，提高與背景的反差。近年熒光染色在真菌感染的檢測中應(yīng)用越來越多，但多集中在淺部真菌或體液等新鮮樣本的快速檢測，如各種毛發(fā)、甲屑、皮屑、痰液、角膜涂片和陰道分泌物等，與傳統(tǒng)的KOH濕片法相比，熒光染色具有敏感性強、陽性率高的特點[5,8]。然而，熒光染色法在石蠟包埋組織中的應(yīng)用卻鮮有報道。

①②③④⑤

本實驗將熒光染色用于隱球菌病石蠟包埋組織標(biāo)本的檢測，熒光染色結(jié)果和PAS染色及六胺銀染色結(jié)果一致，但是熒光染色隱球菌菌壁呈亮藍色，背景呈藍黑色，反差更明顯，菌體結(jié)構(gòu)更清晰。相比之下，PAS染色雖然操作也很簡單，但其還能顯示組織中的糖原、中性黏液、基膜和一些炎癥細胞等，背景呈紅色，與隱球菌紫紅色菌壁反差不明顯，影響結(jié)果的判讀，易漏診。六胺銀染色結(jié)果反差明顯，背景為紅色，菌壁呈深黑色，隱球菌容易辨認(rèn)，但是染色操作復(fù)雜，整個過程持續(xù)時間較長，需多次進行顯微鏡觀察，并且切片易受銀沉淀污染，對玻璃儀器的清潔度要求較高。熒光染色步驟簡單，滴加染液后僅需1～2 min便可進行鏡下觀察，也有報道稱熒光染色標(biāo)本鏡檢的時間可縮短至30～60 s[9]，大大提高了染色的效率。熒光染色后的切片也可以重復(fù)使用，節(jié)省了制片的成本。需要注意的是，熒光染色法組織中的彈力纖維以及玻片上存在的少量纖維也可發(fā)出熒光[7-8]，但其形態(tài)與隱球菌有較大差異，憑經(jīng)驗一般可以避免假陽性情況的發(fā)生。考慮到熒光淬滅快，制片后需盡快進行鏡下觀察和拍照。本實驗發(fā)現(xiàn)石蠟包埋組織隱球菌熒光染色后，一般可在暗處存放2～3天，熒光逐漸減弱，背景開始增強。

綜上所述，本實驗證實了熒光染色法在石蠟包埋組織中檢測隱球菌的可行性。該方法操作簡便、快捷省時，染色結(jié)果直觀明確。隨著熒光顯微鏡使用的增多，熒光染色法是檢測隱球菌病石蠟包埋組織的一種快速有效方法。