張玉萍，候 倩，蔡曉珊，徐國(guó)棟，馬 昊，王 慧，張?jiān)葡?/p>

胸腺上皮性腫瘤(thymic epithelial tumors, TET)是起源于胸腺上皮細(xì)胞或向胸腺上皮分化的腫瘤，其生物學(xué)特征是從具有惡性潛能到惡性的過(guò)程[1]。TET以手術(shù)為主輔助放、化療等多學(xué)科治療，但部分患者預(yù)后較差。目前TET分子生物學(xué)特征尚不清楚，分析TET的發(fā)病機(jī)制、分子靶標(biāo)迫在眉睫。PD-1/PD-L1單抗是當(dāng)前備受矚目的新一代免疫療法，經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，現(xiàn)已有多種PD-1/PD-L1單抗用于惡性腫瘤的臨床治療，并取得較好的療效，且Le等[2]發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)狀態(tài)可用于預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑的療效。近年研究顯示PD-L1表達(dá)與TET惡性程度及預(yù)后相關(guān)[3-4]，但關(guān)于MMR在TET報(bào)道較少。本文通過(guò)檢測(cè)TET中PD-L1和MMR蛋白的表達(dá)，旨在探討兩者表達(dá)與TET臨床病理特征之間的關(guān)系，以期對(duì)TET免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016～2019年山東省濰坊市人民醫(yī)院和山東省濰坊市第二人民醫(yī)院病理科手術(shù)切除，經(jīng)病理檢查確診為T(mén)ET標(biāo)本60例。根據(jù)WHO(2015)胸腺腫瘤組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，由兩名病理醫(yī)師復(fù)閱切片明確腫瘤的組織學(xué)分型，對(duì)有足夠腫瘤細(xì)胞組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)；另收集相關(guān)臨床病理資料。

1.2 方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片。免疫組化采用EnVision兩步法染色。MMR用已知陽(yáng)性組織做陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照；PD-L1采用試劑盒陰陽(yáng)性切片做對(duì)照。MLH1試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，MSH2、MSH6、PMS2試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，PD-L1試劑盒購(gòu)自Dako公司。

1.3 結(jié)果判讀MMR定位于細(xì)胞核，在陽(yáng)性對(duì)照及內(nèi)對(duì)照(上皮細(xì)胞、正常腸上皮特別是腺體基底部細(xì)胞、間皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)陽(yáng)性前提下，腫瘤細(xì)胞核著色即判讀為陽(yáng)性[5]。至少一種蛋白表達(dá)缺失提示為MMR表達(dá)缺失(deficient mismatch repair, dMMR)，4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白均表達(dá)時(shí)，判為錯(cuò)配修復(fù)功能完整(proficient mismatch repair, pMMR)；通常MLH1聯(lián)合PMS2表達(dá)缺失，而MSH2聯(lián)合MSH6表達(dá)缺失[6]。PD-L1定位于細(xì)胞膜，根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度判斷：0～2分為陰性，3～5分為陽(yáng)性[7-9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PD-L1和MMR蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征各組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率法檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)性應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)60例TET中胸腺瘤46例、胸腺癌14例，其中A型胸腺瘤12例，AB型胸腺瘤10例，B1型胸腺瘤10例，B2型胸腺瘤9例，B3型胸腺瘤5例，胸腺癌14例；男性27例，女性33例；患者年齡25～80歲，中位年齡57歲，好發(fā)于50歲以后；腫瘤直徑2.0～22 cm；17例伴重癥肌無(wú)力；17例伴淋巴結(jié)或其他器官轉(zhuǎn)移，其中胸腺癌有11例發(fā)生轉(zhuǎn)移。

2.2 TET中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系60例TET中35例(58.33%)PD-L1陽(yáng)性，其中A型胸腺瘤3例，AB型胸腺瘤5例，B1型胸腺瘤6例，B2型胸腺瘤6例，B3型胸腺瘤4例，胸腺癌11例；PD-L1在B3型胸腺瘤和胸腺癌的表達(dá)顯著高于A、AB、B1和B2型胸腺瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)；PD-L1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否伴重癥肌無(wú)力，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1，圖1)。

表1 胸腺上皮性腫瘤中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 TET中MMR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系60例TET中有11例(18.33%)發(fā)生MMR蛋白表達(dá)缺失，以MLH1和PMS2聯(lián)合缺失為主(11.67%，7/60)。MSH2和MSH6在所有病例中均呈陽(yáng)性。MMR蛋白缺失主要發(fā)生在A型胸腺瘤，明顯高于AB、B1、B2、B3型胸腺瘤和胸腺癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)；MMR蛋白缺失與患者性別、年齡、腫瘤大小、有無(wú)轉(zhuǎn)移、是否伴重癥肌無(wú)力，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，圖2)。

2.4 PD-L1與MMR表達(dá)的相關(guān)性本組結(jié)果顯示：PD-L1表達(dá)與MMR蛋白缺失之間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 結(jié)論

TET臨床罕見(jiàn)，探索有價(jià)值的分子標(biāo)志物對(duì)其發(fā)病機(jī)制、治療、預(yù)后均具有重要的臨床意義[10]。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重大作用。目前，PD-1/PD-L1通路被認(rèn)為是最重要的腫瘤免疫抑制通路。PD-L1與PD-1結(jié)合，通過(guò)傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，抑制T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)控和殺傷促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，因此通過(guò)抑制PD-1/PD-L1通路可達(dá)到治療腫瘤的目的[11-12]。研究表明PD-L1和MMR基因是免疫靶向藥物療效預(yù)測(cè)的重要標(biāo)志物[2]，本組PD-L1在TET中的陽(yáng)性率為58.33%，回顧文獻(xiàn)[3,13-19]發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白在胸腺瘤中陽(yáng)性率為18%～92%，可能與使用抗體克隆號(hào)不同、判讀標(biāo)準(zhǔn)不同、判讀主觀性及表達(dá)異質(zhì)性等相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在胸腺癌和惡性程度高的胸腺瘤中高表達(dá)，且PD-L1高表達(dá)可作為腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后差的標(biāo)志物[3,7，14]。本組中PD-L1在B3型胸腺瘤和胸腺癌中的表達(dá)明顯高于其他類(lèi)型胸腺瘤，表明PD-L1高表達(dá)與TET的惡性程度高相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小等臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性，與Katsuya等[13]研究一致。

①A①B①C①D②A②B②C②D

表2 胸腺上皮性腫瘤中MMR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

MMR主要功能是糾正DNA復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤，但在DNA甲基化或基因突變導(dǎo)致MMR功能異?；蛉笔У那闆r下會(huì)使微衛(wèi)星重復(fù)序列核酸數(shù)量增多或減少，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[20]。本組60例TET中有11例發(fā)生MMR蛋白缺失，以MLH1和PMS2聯(lián)合缺失為主，與以往研究結(jié)果一致[6]。MMR蛋白缺失在A型胸腺瘤中明顯高于其他類(lèi)型胸腺瘤和胸腺癌，可能與A型胸腺瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證；與患者性別、年齡、腫瘤大小、有無(wú)轉(zhuǎn)移、是否伴重癥肌無(wú)力無(wú)關(guān)。進(jìn)一步對(duì)PD-L1和MMR蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)與MMR蛋白缺失之間無(wú)相關(guān)性，分析原因有以下兩點(diǎn)：(1)本組中PD-L1表達(dá)與MMR蛋白缺失無(wú)相關(guān)性，可能與實(shí)驗(yàn)樣本量小、樣本區(qū)域局限性有關(guān)；(2)文獻(xiàn)報(bào)道32種不同腫瘤類(lèi)型的合計(jì)12 019例患者中，dMMR患者比例>5%的腫瘤僅占37.5%(12/32)[21]，dMMR的發(fā)生頻率較低，因此僅應(yīng)用dMMR狀態(tài)篩選獲益的患者，可能會(huì)忽略部分對(duì)PD-1/PD-L1 單抗治療敏感的患者，應(yīng)綜合考慮。

綜上所述，PD-L1高表達(dá)于B3型胸腺瘤和胸腺癌中，與TET惡性程度高相關(guān)，為臨床采用以PD-1/PD-L1為免疫靶點(diǎn)治療TET提供可能。我們還需收集更多樣本，深入探討PD-L1表達(dá)與MMR蛋白缺失在TET中的作用機(jī)制，為T(mén)ET免疫治療提供更有價(jià)值的理論依據(jù)。