陳筱雪，郭 超，孫 斌，鄭孟文，賈永娜，黎昌學(xué)

破骨細(xì)胞增殖和凋亡在骨吸收及重建過(guò)程中具有重要作用，是多種細(xì)胞因子及基因參與的調(diào)控機(jī)制。TGF-β是TGF細(xì)胞因子超家族的成員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、黏附及刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成的功能，可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[1]，同時(shí)在骨重建、創(chuàng)傷修復(fù)和胚胎發(fā)育中起重要作用。因其高度的復(fù)雜性和多樣化[2-3]，有關(guān)TGF-β對(duì)破骨細(xì)胞的影響報(bào)道較少。線粒體Caspase作為已知的主要凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，能通過(guò)水解各種細(xì)胞成分使細(xì)胞凋亡。RAW264.7為小鼠破骨前體細(xì)胞系，可誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞[4]。本文著重探討TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并闡明TGF-β及其濃度對(duì)骨重建的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器小鼠破骨前體細(xì)胞RAW264.7(漢恒生物細(xì)胞庫(kù))；DMEM 培養(yǎng)基(Hy Clone，美國(guó))，小鼠重組sRANKL、M-CSF(Promo Cell，德國(guó))；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(APPLYGEN，北京)；PCR擴(kuò)增儀(ABI，美國(guó))；引物由南京諾唯贊生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將破骨細(xì)胞前體細(xì)胞系RAW264.7在含有青鏈霉素混合液及10%胎牛血清的高葡萄糖-DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，傳至第三代行細(xì)胞接種鋪板。接種24 h，使用50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF在細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞。

1.2.2CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，24 h后按照TGF-β不同濃度分為對(duì)照組和3個(gè)不同濃度處理組。對(duì)照組：TGF-β濃度為0 ng /mL；處理組：TGF-β每組濃度分別為1、2、5 ng /mL。分組觀察，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔分別加入20 μL CCK-8；使用酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果中細(xì)胞增殖情況得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的TGF-β濃度為5 ng/mL，設(shè)置其為TGF-β組濃度，選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞。設(shè)置2個(gè)組分別為：對(duì)照組、TGF-β組(僅加入TGF-β濃度為5 ng/mL)。24 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)正常后加藥，細(xì)胞5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。另設(shè)空白組用于流式細(xì)胞儀調(diào)試，培養(yǎng)72 h進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.4RT-PCR檢測(cè) 將RAW264.7細(xì)胞分為2組分別為：對(duì)照組(僅在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng))、TGF-β組(加入TGF-β濃度為5 ng/mL)。培養(yǎng)72 h后提取總RNA。紫外分光光度儀檢測(cè)A260/A280比率以驗(yàn)證RNA純度和濃度。合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR。取cDNA 1 μL，SYBR Green Master mix 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min預(yù)熱，95 ℃時(shí)15 s變性，60 ℃時(shí)1 min退火延伸，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。將樣品在4 ℃下保持30 min，并將每個(gè)樣本重復(fù)3次。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。所用引物詳見表1。

表1 RT-PCR 的引物序列

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)分別加入1、2、5 ng/mL的TGF-β時(shí)，RAW264.7細(xì)胞增殖數(shù)均低于對(duì)照組，處理72 h時(shí)TGF-β(5 ng/mL)處理組與其他濃度處理組和對(duì)照組差異有顯著性(P<0.05，圖1)。提示TGF-β可抑制RAW264.7細(xì)胞增殖，其抑制作用隨著濃度及時(shí)間的增長(zhǎng)而加強(qiáng)，呈時(shí)間、劑量依賴性。

圖1 CCK-8檢測(cè)TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響：*P<0.05

2.2 TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響處理72 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，TGF-β(5 ng/mL)處理組與對(duì)照組相比細(xì)胞總凋亡率升高(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)TGF-β處理細(xì)胞72 h后，TGF-β(5 ng/mL)處理組與對(duì)照組相比，總凋亡率增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)線粒體凋亡通道Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達(dá)對(duì)照組用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β(5 ng/mL)處理組加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，對(duì)RAW264.7細(xì)胞干預(yù)72 h，與對(duì)照組相比，TGF-β(5 ng/mL)處理組Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

3 討論

骨組織缺損修復(fù)機(jī)制是目前關(guān)注的重點(diǎn)，除骨創(chuàng)傷修復(fù)外，其還與骨質(zhì)疏松甚至骨腫瘤相關(guān)[5]，且與牙槽骨吸收等口腔常見疾病有直接關(guān)系[6]。骨改建是一個(gè)連續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，主要通過(guò)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間相互作用共同調(diào)控新骨形成達(dá)到骨重建。其中，破骨細(xì)胞來(lái)自骨髓單核/巨噬細(xì)胞系，負(fù)責(zé)吸收骨組織中的骨質(zhì)，是影響骨折愈合的關(guān)鍵細(xì)胞之一[7]。近年，骨折愈合過(guò)程中TGF-β調(diào)節(jié)的研究成為焦點(diǎn)。作為功能相似、結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子和趨化因子，TGF-β影響骨生長(zhǎng)、形態(tài)誘導(dǎo)和修復(fù)，具有重要研究?jī)r(jià)值。多種研究表明，TGF-β對(duì)骨組織的影響是雙向的。長(zhǎng)期以來(lái)TGF-β被認(rèn)為是一種骨吸收抑制劑，高濃度的TGF-β可以增強(qiáng)骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)和RANK的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制RANK與其配體的結(jié)合，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的分化和成熟受到抑制。最近研究表明，在缺乏基質(zhì)細(xì)胞的體外環(huán)境中，TGF-β可以誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞中NF-κB和RANK的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[8-9]。因此，其對(duì)破骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響一直存在爭(zhēng)議。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7是公認(rèn)的破骨前體細(xì)胞，體外可以誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞[10]。目前文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響較小，且本課題組前期報(bào)道由于巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)與RANK在RAW264.7細(xì)胞系中可以同時(shí)表達(dá)，由此激活RANKL從而使RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞[11]。故在此基礎(chǔ)上通過(guò)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立破骨細(xì)胞模型進(jìn)行相關(guān)分析。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況:A.對(duì)照組；B.TGF-β組

圖3 TGF-β對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響：與對(duì)照組相比，*P<0.05

圖4 線粒體凋亡通道Caspase-3(A)、Caspase-8(B)mRNA表達(dá)差異：與對(duì)照組相比，*P<0.05

本組CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處于24、48和72 h的RAW264.7細(xì)胞增殖數(shù)低于對(duì)照組，增殖受到抑制，且72 h時(shí)TGF-β(5 ng/mL)處理組與其他濃度處理組及對(duì)照組差異有顯著性。這些結(jié)果表明TGF-β可抑制RAW264.7細(xì)胞增殖，且其抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性。根據(jù)前期CCK-8實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5 ng/mL的TGF-β處理72 h后RAW264.7細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組差異有顯著性。提示TGF-β可以抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，從而可以減少破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)到減少或終止骨吸收的目的。其結(jié)果可能與TGF-β誘導(dǎo)的劑量、時(shí)間以及靶細(xì)胞內(nèi)有信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活狀態(tài)有關(guān)。Quinn等[12]認(rèn)為骨吸收中TGF-β刺激成骨細(xì)胞下調(diào)RANKL表達(dá)，增加OPG表達(dá)。RANKL/RANK復(fù)合物減少，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的增殖和分化減少。此外有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠特異性激活SMAD信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并且調(diào)控細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞增殖受到抑制。TGF-β還可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的磷酸化降解，干擾β-catenin向細(xì)胞核移位進(jìn)而阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[13]，這與本組流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。

除上述傳導(dǎo)途徑外，Caspase線粒體凋亡通路也是常見的經(jīng)典凋亡通路[14]。Caspase-8為凋亡啟動(dòng)因子，在其它蛋白輔助下發(fā)生自我活化，并激活下游的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3等導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在5 ng/mL的TGF-β作用下RAW264.7細(xì)胞線粒體凋亡通道相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)，可以在分子水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TGF-β誘導(dǎo)組中，Caspase-3、Caspase-8表達(dá)水平顯著升高，表明RAW264.7細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，與Quinn等[12]報(bào)道一致，TGF-β能增加RAW264.7細(xì)胞相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞數(shù)量，抑制骨組織吸收。

綜上所述，本組分析不同濃度及時(shí)間下TGF-β對(duì)破骨前體細(xì)胞RAW264.7增殖和凋亡的作用，證實(shí)TGF-β作用于RAW264.7細(xì)胞可使其增殖減緩，并通過(guò)激活線粒體凋亡通道Caspase-3、Caspase-8信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，減緩甚至終止骨吸收的進(jìn)程，改善骨吸收疾病的預(yù)后。后期還需深入分析骨吸收相關(guān)信號(hào)通路如Wnt等，為藥物靶向治療骨吸收類疾病提供參考。