李明娜，王陸華，化宏金，張煒明，宋國(guó)新，平國(guó)強(qiáng)，張智弘

胰腺癌是病死率最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年其發(fā)病率呈逐年上升及年輕化趨勢(shì)，在所有惡性腫瘤中病死率位于第4位[1]。其中胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)占胰腺癌的80%以上。骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族的一員，與許多正?；蚰[瘤組織的細(xì)胞類型相互作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)OPG是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、骨肉瘤和前列腺癌的腫瘤存活因子[3-5]，但在胰腺癌中的研究有限。KRAS突變是PDAC中最常見(jiàn)的突變基因，是胰腺癌發(fā)生的早期事件[6]，并控制胰腺疾病的發(fā)展[7]。本文采用免疫組化染色檢測(cè)OPG在PDAC組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征、KRAS基因突變及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2008年1月1日～2012年12月31日南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為PDAC標(biāo)本102例，所有病理切片及組織蠟塊由兩名病理醫(yī)師同時(shí)閱片，每例均選取癌組織和癌旁組織各1塊。臨床資料包括患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤大小、TNM分期、糖尿病史、總生存期等，所有病例術(shù)前均未行放、化療及其他治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)回顧電子病歷、臨床數(shù)據(jù)及隨訪時(shí)間更新至2016年6月。

1.2 組織芯片及免疫組化染色標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制作組織芯片。納入本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本102對(duì)(均為癌組織及癌旁組織)。組織芯片制作使用美國(guó)Beecher組織芯片陣列儀，選擇1.5 mm孔徑。組織芯片圖譜與各樣本的臨床病理特征相對(duì)應(yīng)。組織芯片4 μm厚，免疫組化染色采用EnVision法。一抗OPG抗體購(gòu)自Abcam公司，稀釋比為1 ∶800。

1.3 結(jié)果判讀免疫組化結(jié)果判讀由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立完成。OPG免疫組化染色陽(yáng)性呈棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)。(1)按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。最后將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘，OPG染色>1.5分即定義為OPG高表達(dá)，相反則為OPG低表達(dá)(按總生存期對(duì)腫瘤組織OPG表達(dá)進(jìn)行ROC曲線分析，顯示OPG最佳閾值為1.5)(圖1)。

1.4 KRAS基因檢測(cè)采用廈門艾德公司的試劑盒，運(yùn)用ABI7500熒光定量PCR儀，對(duì)其中46例腫瘤組織KRAS基因第12、13號(hào)外顯子突變情況進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

圖1 OPG的ROC曲線預(yù)測(cè)腫瘤特異性存活期(OPG最佳閾值為1.5)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。腫瘤組織OPG表達(dá)、KRAS突變與臨床病理特征比較采用Person和Spearman相關(guān)性分析；死亡組和生存組一般資料比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)；ROC曲線用于預(yù)測(cè)OPG高表達(dá)的閾值；單因素生存分析和多因素生存分析采用Cox回歸分析和Kaplan-Meier函數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征102例PDAC分為死亡組和生存組，死亡組78例，生存組24例；男性62例，女性40例；年齡32～82歲；臨床分期ⅠA期3例，ⅠB期7例，ⅡA期39例，ⅡB期40例，Ⅲ期12例，Ⅳ期1例；術(shù)后化療30例。

2.2 死亡組和生存組比較死亡組中術(shù)后化療占24.4%，生存組中占45.8%。死亡組中腫瘤組織OPG高表達(dá)占85.9%，而生存組中腫瘤組織OPG高表達(dá)占25%，死亡組腫瘤組織OPG高表達(dá)遠(yuǎn)高于生存組。腫瘤分化差(P=0.001)、腸系膜上靜脈受侵犯(P=0.006)、術(shù)后未化療(P=0.043)和OPG高表達(dá)(P<0.001)是影響PDAC預(yù)后的因素(表1)。

2.3 PDAC及癌旁組織中OPG的表達(dá)PDAC中OPG高表達(dá)率和低表達(dá)率分別為71.6%和28.4%；而癌旁組織中OPG高表達(dá)率和低表達(dá)率分別為51.0%和49.0%。OPG表達(dá)在PDAC和癌旁組織中的差異有顯著性(P<0.01，表2，圖2)。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌死亡組和生存組比較[n(%)]

表2 胰腺導(dǎo)管腺癌與癌旁組織中OPG的表達(dá)[n(%)]

2.4 PDAC中OPG表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系腫瘤組織OPG表達(dá)與腫瘤分化程度、腸系膜上動(dòng)脈受侵犯、腸系膜上靜脈侵犯、門靜脈、術(shù)后化療均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表3)。

2.5 PDAC中KRAS突變與臨床特征的相關(guān)性46例PDAC進(jìn)行KRAS突變檢測(cè)，其中24例野生型(52.2%)，22例突變型(47.8%)，包括KRAS外顯子2(G12D/S)突變10例，KRAS外顯子2(G12V/A/R/C/G13C)突變12例。相關(guān)性分析顯示KRAS突變只與糖尿病有關(guān)(P=0.025)，與OPG表達(dá)及其他臨床病理特征無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表4)。

2.6 Cox單因素和多因素生存分析患者總生存期為1～72個(gè)月，中位總生存期為13.25個(gè)月，死亡78例，生存24例。Cox單因素生存回歸分析顯示：腫瘤大小(P=0.008)、分化程度(P<0.001)、腸系膜上動(dòng)脈受侵犯(P=0.043)、腸系膜上靜脈受侵犯(P=0.004)、門靜脈受侵犯(P=0.033)、術(shù)后化療(P=0.023)、OPG表達(dá)(P<0.001)與PDAC患者預(yù)后顯著相關(guān)。將腫瘤分化程度、術(shù)后化療、OPG納入Cox多因素生存分析結(jié)果顯示：OPG是PDAC患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.001)。使用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)一步分析OPG表達(dá)的預(yù)后意義，結(jié)果顯示OPG高表達(dá)患者的生存期遠(yuǎn)低于低表達(dá)患者(P<0.01，圖3)。

ABCD

表3 胰腺導(dǎo)管腺癌中OPG表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表4 胰腺導(dǎo)管腺癌中KRAS突變與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

圖3 Kaplan-Meier生存曲線顯示OPG表達(dá)對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌患者總生存期的影響

2.7 PDAC中KRAS突變與預(yù)后的相關(guān)性PDAC組中KRAS野生型與較差預(yù)后相關(guān)(P=0.013)。進(jìn)一步分析顯示：46例患者中術(shù)后化療10例(10/46)，其中KRAS野生型6例(6/10)，突變型4例(4/10)；術(shù)后未化療合計(jì)36例，其中KRAS野生型和突變型各18例。使用Kaplan-Meier生存曲線分析KRAS突變的預(yù)后意義，結(jié)果顯示KRAS突變型患者中位生存期為15個(gè)月，野生型患者中位生存期為11個(gè)月，突變型患者的生存期高于野生型患者(P=0.013，圖4)。

圖4 KRAS野生型和突變型的胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存曲線

3 討論

胰腺癌是惡性程度高、預(yù)后差的消化系統(tǒng)腫瘤。目前，針對(duì)胰腺癌是以手術(shù)治療為主，結(jié)合放、化療等綜合治療。近年許多研究發(fā)現(xiàn)OPG可以作為TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的可溶性誘騙性受體，與TRAIL結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞逃逸TRAIL所誘導(dǎo)的凋亡，達(dá)到抗凋亡和促增殖的作用[3]。明確OPG在胰腺癌中的表達(dá)及與其他因素的相關(guān)性為治療提供新方向。

文獻(xiàn)報(bào)道OPG在胰腺正常組織和癌組織中均可表達(dá)，但在癌組織中表達(dá)更高[8]。本組對(duì)102例PDAC的OPG表達(dá)進(jìn)行分析，PDAC組織中OPG高表達(dá)和低表達(dá)分別為71.6%和28.4%；而胰腺癌旁正常組織中OPG高表達(dá)及低表達(dá)分別占51.0%和49.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。其他腫瘤中OPG也有類似報(bào)道，如乳腺癌中表達(dá)率為45.9%[9]，肺非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性率為82.7%[10]。這些結(jié)果表明OPG在腫瘤組織表達(dá)更高，這可能與OPG在腫瘤組織中所介導(dǎo)的機(jī)制有關(guān)，上調(diào)OPG表達(dá)水平造成受體分布異常和表達(dá)異常，OPG與死亡受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAIL而降低TRAIL促凋亡的活性，從而使腫瘤細(xì)胞逃逸TRAIL所誘導(dǎo)的凋亡[3]。

本組還發(fā)現(xiàn)在PDAC組織中OPG表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期、腸系膜上動(dòng)脈和腸系膜上靜脈受侵犯、術(shù)后化療以及癌旁組織OPG表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。但有文獻(xiàn)報(bào)道胰腺癌中OPG高表達(dá)除與胰腺癌相關(guān)新發(fā)糖尿病相關(guān)，與其他臨床病理學(xué)特征均無(wú)相關(guān)性[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OPG高表達(dá)與糖尿病無(wú)關(guān)，研究結(jié)果差異原因：(1)樣本中糖尿病例數(shù)少(22例)；(2)22例糖尿病患者病史長(zhǎng)達(dá)半年至數(shù)十年；(3)患者的發(fā)病時(shí)長(zhǎng)無(wú)法判斷是否為新發(fā)糖尿病。與PDAC相比，其他惡性腫瘤中OPG表達(dá)有不同的結(jié)果，胃癌組織中OPG高表達(dá)與深部侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期和預(yù)后差密切相關(guān)[11]。非小細(xì)胞肺癌中OPG高表達(dá)與臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]。浸潤(rùn)性乳腺癌中OPG陽(yáng)性與腫瘤大小、陰性淋巴結(jié)數(shù)和Ki-67低增殖指數(shù)有關(guān)[9]。結(jié)直腸癌中OPG表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。研究結(jié)果差異原因：(1)樣本的選擇及樣本量的差異；(2)對(duì)于OPG的表達(dá)及陽(yáng)性界定無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)明確的閾值[13-14]；(3)不同腫瘤的異質(zhì)性不同。

OPG的預(yù)后意義已經(jīng)在各惡性腫瘤中得到證實(shí)，OPG高表達(dá)與較差預(yù)后相關(guān)，OPG水平可以作為腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物或作為預(yù)后指標(biāo)[10-12,15]。Shi等[8]研究發(fā)現(xiàn)OPG過(guò)表達(dá)提示胰腺癌預(yù)后不良，并且可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素，本實(shí)驗(yàn)與其結(jié)果相符。

關(guān)于OPG在腫瘤治療中所起的作用，臨床研究重組OPG在與腫瘤相關(guān)的骨溶解中的治療潛力[2], OPG可能是轉(zhuǎn)移性乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤中骨溶解的治療選擇[16]。因此，作者猜想靶向抑制OPG與TRAIL的結(jié)合可能是治療胰腺癌的方法。然而，包括PDAC在內(nèi)的幾種腫瘤細(xì)胞顯示了抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道突變的KRASG12D降低TRAIL誘導(dǎo)的PDAC細(xì)胞凋亡的敏感性，但是KRASG12D促進(jìn)TRAIL抗性的機(jī)制尚不清楚。Kanzaki等[17]報(bào)道PDAC中OPG表達(dá)與TRAIL誘導(dǎo)的凋亡敏感性相關(guān)，沉默OPG使細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡敏感。同時(shí)發(fā)現(xiàn)OPG生成水平與KRAS突變狀態(tài)呈正相關(guān)，沉默KRAS可以在胰腺癌細(xì)胞中降低OPG水平，增加對(duì)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。本組分析OPG表達(dá)與KRAS基因突變的相關(guān)性，并未發(fā)現(xiàn)兩者顯著相關(guān)。但需要說(shuō)明的是，本實(shí)驗(yàn)樣本并非胰腺癌細(xì)胞系，并非所有納入本組病例均進(jìn)行KRAS檢測(cè)，故所得出的結(jié)論可能存在一定的偏倚。因此，OPG與KRAS基因突變的關(guān)系需要更多的數(shù)據(jù)來(lái)支持。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為PDAC中OPG高表達(dá)提示較差的預(yù)后，是總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。OPG可能作為PDAC的一種新型預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，深入分析胰腺癌中OPG表達(dá)與KRAS基因突變有重要的臨床價(jià)值。