孟曉樂(lè)，李 慧，張書銘，王桂梅，唐華美

結(jié)直腸癌是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在北美和歐洲位居第2位，在中國(guó)位居第5位，城市地區(qū)比農(nóng)村高發(fā)，并且近年發(fā)病率迅速上升[1-2]。盡管手術(shù)切除和新輔助治療改善了部分結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是其預(yù)后不良的主要原因[3]。目前結(jié)直腸癌的研究主要集中于探索調(diào)控其發(fā)生和進(jìn)展的分子靶標(biāo)。因此，迫切需要深入揭示結(jié)直腸癌的分子轉(zhuǎn)移過(guò)程，尋找更有效抑制其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的診療靶點(diǎn)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(lipocalin 2, Lcn2)是lipocalin超家族的成員之一，也稱為中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)，相對(duì)分子質(zhì)量為2.5×104，參與運(yùn)輸疏水小分子，如視黃醇和維生素D，并且調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和前列腺素的合成[4-5]。多種腫瘤如乳腺癌[6-7]、肝細(xì)胞癌[8]、食管癌[9]、腎透明細(xì)胞癌[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]、結(jié)直腸癌[12-13]及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[14]等均已被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，表明其可能是惡性腫瘤中潛在的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，而Lcn2在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的功能作用仍存在較大爭(zhēng)議。本文主要探討Lcn2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征關(guān)系，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018～2019年福建醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)B門弘愛(ài)醫(yī)院存檔的40例結(jié)直腸癌標(biāo)本，所有患者均未行放、化療，臨床病理資料均完整。新鮮組織標(biāo)本離體20 min內(nèi)，快速收集并冷凍于-80 ℃冰箱，術(shù)后常規(guī)病理活檢標(biāo)本進(jìn)行切片染色。另收集距腫瘤>5 cm的正常腸黏膜組織作為對(duì)照。

1.2 主要試劑RNA 提取試劑：Total RNA Extractor (Trizol)、乙醇(Ethanol absolute)、異丙醇(Isopropanol)購(gòu)自Sangon Biotech公司，三氯甲烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fast King RT Kit)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SuperReal PreMix Plus-SYBR Green)購(gòu)自TIANGEN公司。Lcn2正向引物：3′-TC ACCTCCGTCCTGTTTAGG-5′，反向引物：3′-CGAAG TCAGCTCCTTGGTTC-5′；actin正向引物：3′-AAGGT GACAGCAGTCGGTT-5′，反向引物：3′-TGTGTGGA CTTGGGAGAGG-5′，由上海生工生物合成。兔抗人抗體Lcn2/NGAL(ab125075)、鼠抗人β-tubulin(ab6046)購(gòu)自Abcom公司，山羊抗兔及抗鼠二抗均購(gòu)自三箭生物公司。組織裂解液RIPA等購(gòu)自索萊寶公司。Western blot試劑及BCA蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司，顯色液購(gòu)自Bio-Rad公司。免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鈉等，均購(gòu)自福州邁新公司。石蠟組織標(biāo)本用二甲苯、梯度乙醇等處理。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 將冷凍于-80 ℃冰箱的新鮮組織經(jīng)液氮冷凍研磨破碎后加入Trizol裂解液獲取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR檢測(cè)：每組樣品3個(gè)重復(fù)，以actin作為內(nèi)參，分別檢測(cè)癌與癌旁組織，取Ct均值，計(jì)算△Ct和△△Ct，最后求2-△△Ct值，即為癌組織的mRNA相對(duì)含量。qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，1.5%濃度的膠，130 V電泳30 min。

1.3.2Western blot法 將冷凍于-80 ℃冰箱的新鮮組織經(jīng)液氮冷凍研磨破碎后經(jīng)RIPA裂解，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。樣品煮沸后進(jìn)行Western blot電泳。5%的牛奶室溫封閉2 h；一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜；二抗室溫?fù)u床2 h；抗體洗滌液為TBST，每次10 min，合計(jì)3次。

1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用SP法，標(biāo)本5 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟；梯度乙醇至水；pH 6.0檸檬酸鈉抗原熱修復(fù)；過(guò)氧化物酶阻斷；血清封閉；一抗4 ℃過(guò)夜；生物素二抗孵育；DAB顯色；蘇木精復(fù)染。免疫組化結(jié)果經(jīng)病理科3名診斷醫(yī)師評(píng)估。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。兩項(xiàng)結(jié)果相乘：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，≥9分為()；其中<5分為低表達(dá)，≥5分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用Graph Pad 7.0、Image J進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)處理，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及矯正χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中Lcn2的mRNA水平應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)Lcn2的mRNA相對(duì)含量，actin、Lcn2的cDNA片段長(zhǎng)度分別為195、242 bp(圖1A)，內(nèi)參actin基本一致，經(jīng)相同擴(kuò)增次數(shù)后結(jié)直腸癌組織Lcn2的條帶更亮，癌旁組織條帶較暗。統(tǒng)計(jì)分析40例配對(duì)樣品中Lcn2的相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct)，癌組織中Lcn2的mRNA水平較癌旁組織明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 5，圖1B)。

2.2 Western blot法檢測(cè)結(jié)直腸癌中Lcn2 蛋白水平總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，內(nèi)參β-tubulin相對(duì)分子質(zhì)量為5.5×104，Lcn2相對(duì)分子質(zhì)量為2.5×104，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織內(nèi)Lcn2蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁組織，且Lcn2/β-tubulin的蛋白相對(duì)表達(dá)量在結(jié)直腸癌組織中升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)Lcn2在配對(duì)結(jié)直腸癌組織中的mRNA水平：A.凝膠電泳：1～3.癌旁組織中Lcn2，4～6.結(jié)直腸癌組織中Lcn2，7～9.癌旁組織中actin，10～12.結(jié)直腸癌組織中actin，13.DNA ladder；B.配對(duì)結(jié)直腸癌組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖2 Western blot法檢測(cè)Lcn2在配對(duì)結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)：A. Western blot分析，N.癌旁組織，T.結(jié)直腸癌組織；B.Western blot條帶灰度值比

2.3 結(jié)直腸癌中Lcn2的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)直腸癌與癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色，高倍鏡視下見結(jié)直腸癌組織間質(zhì)中浸潤(rùn)的腺管上皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜呈棕黃色(圖3A)，癌旁組織上皮細(xì)胞胞質(zhì)呈淺棕色或無(wú)著色(圖3B)。根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度與陽(yáng)性率進(jìn)行評(píng)分，統(tǒng)計(jì)分析Lcn2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：Lcn2蛋白在腫瘤直徑>5 cm(100%，P=0.014)、腫瘤分化程度低(92.31%，P=0.017)、T4分期(92%，P=0.042)及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(92.31%，P=0.025)的患者中陽(yáng)性率顯著升高；與其他臨床病理特征均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。尤其是在腫瘤直徑>5 cm、分化程度較低、分期高及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，更易出現(xiàn)Lcn2的表達(dá)上調(diào)(表1)。

表1 結(jié)直腸癌中Lcn2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

AB

3 討論

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，經(jīng)手術(shù)切除和新輔助治療后患者預(yù)后有明顯改觀，但轉(zhuǎn)移瘤的出現(xiàn)仍然較常見，因此研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制中新的標(biāo)志物或靶標(biāo)對(duì)患者預(yù)后具有重大的臨床意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞均可表達(dá)Lcn2，且可廣泛游離于細(xì)胞外液和體液中，炎癥、缺氧及胰島素水平變化等刺激可升高其單體、二聚體及復(fù)合物的合成和釋放；而影響腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵問(wèn)題在于：Lcn2啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移侵襲、免疫耐受、血管生成等生物學(xué)功能的方式是由內(nèi)向外還是由外向內(nèi)發(fā)揮作用。部分研究證實(shí)Lcn2通過(guò)聯(lián)合表達(dá)MMP-9來(lái)調(diào)節(jié)維持細(xì)胞高度的凝膠活性作用，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[6,15]。本組免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，Lcn2高表達(dá)的比例為92.31%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移僅為57.14%；且無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者Lcn2高表達(dá)的比例達(dá)79.49%，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者僅1例，由于標(biāo)本較少未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kim等[12]發(fā)現(xiàn)Lcn2具有腫瘤抑制基因的作用，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中沉默Lcn2可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和高度糖酵解，瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中能量需求旺盛伴隨有氧糖酵解效應(yīng)(Warburg效應(yīng))并為其提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，Lcn2通過(guò)能量代謝的重編程負(fù)向調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并抑制EMT，與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，Lcn2抑制腫瘤轉(zhuǎn)移還涉及部分信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，F(xiàn)eng等[13]發(fā)現(xiàn)Lcn2抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是通過(guò)減弱NF-κB依賴形式的Snail激活和EMT。值得注意的是，Candido直接通過(guò)組織芯片分析原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶內(nèi)Lcn2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)Lcn2的表達(dá)水平明顯低于原發(fā)灶[16]。曹亞男等[17]報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)Lcn2的表達(dá)在骨轉(zhuǎn)移組高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，且骨轉(zhuǎn)移灶內(nèi)Lcn2表達(dá)也高于原發(fā)灶。Lcn2表達(dá)模式在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位出現(xiàn)明顯分歧，本組病例中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者僅1例，其原發(fā)灶Lcn2高表達(dá)，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者中有31例原發(fā)灶也發(fā)現(xiàn)Lcn2高表達(dá)(79.49%)，側(cè)面反映出Lcn2在結(jié)直腸癌原發(fā)灶的高表達(dá)模式，對(duì)于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和特定轉(zhuǎn)移灶分析。因此，Lcn2在腫瘤進(jìn)展中的表達(dá)模式和功能作用仍然存在較大爭(zhēng)議和分歧，尤其是對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用還需要深入研究探索。雖然目前在多種不同腫瘤類型均已表明Lcn2參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，但是其轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用尚未明確，可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的生物學(xué)標(biāo)志物。

本組結(jié)果顯示，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)Lcn2在結(jié)直腸癌組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平升高，免疫組化結(jié)果證實(shí)Lcn2在腫瘤組織中高表達(dá)，提示Lcn2可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。進(jìn)一步臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，Lcn2的表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。但還需要進(jìn)一步研究其與結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)及預(yù)后指標(biāo)的特異性，深入探討其在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)直腸癌中Lcn2的mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌的臨床病理特征密切相關(guān)，提示Lcn2參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展，探究其在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的功能仍需要深入分析。