張明瑜, 康經(jīng)武

(生命有機化學國家重點實驗室, 中國科學院上海有機化學研究所, 上海 200032)

肝素是臨床上廣泛使用的抗凝血藥物。低分子量肝素(LMWHs)是普通肝素通過化學或酶解方法解聚得到的[1]。肝素與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)結合后引起ATⅢ構象的改變,從而將ATⅢ抗凝血酶活性提高1 000倍[2]。與普通肝素相比,低分子量肝素的抗凝血因子10(FXa)與抗凝血酶比例增大,其藥代動力學參數(shù)更易預測,半衰期較長,且副作用較小。因此,LMWHs逐漸取代了普通肝素成為臨床抗凝血藥物的首選[3]。對于某些特殊的患者,如孕婦、兒童、腎衰竭患者、肥胖癥患者及肝素耐受患者,在使用LMWHs治療時需要監(jiān)測血液中藥物的抗凝血活性[4]。

肝素抗凝活性的測定方法有很多種。傳統(tǒng)方法是凝血實驗,包括活化部分凝血時間測定實驗(activated partial thromboplastin time, APTT)、活化凝血時間測定實驗(activated clotting time, ACT)和凝血酶原時間測定實驗(prothrombin time, PT)。這些方法在監(jiān)測異常出血征兆及抗凝血治療過程中發(fā)揮了重要作用。但是采用凝血實驗測定肝素的抗凝活性時,不同實驗室間測定的結果往往有較大偏差[5]。與之相比,基于分光光度法的生色底物法靈敏度高,且易于實現(xiàn)自動化,已成為臨床測定LMWHs抗凝血活性的黃金標準[6]。雖然如此,但這個方法仍然有其局限性。不同批次的生化試劑間活性差異會導致檢測結果出現(xiàn)偏差[7];在檢測全血樣品時,樣品基質會影響分光光度法檢測的靈敏度和準確性。此外,該方法所需樣品量和試劑量相對較大,也增加了測試成本。Harris等[8,9]為了消除樣品基質對測定的影響,發(fā)展了測定LMWHs抗凝血活性的熒光方法,顯著提高了靈敏度。色譜可以將反應混合物分離后進行在線檢測,是研究酶活及酶抑制劑篩選的強有力工具。2013年,我們課題組發(fā)展了體積排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)測定LMWHs的抗凝血活性[10]。這一方法實現(xiàn)了在線混合、反應、分離及檢測的一體化和自動化,顯著減少了樣品量和試劑用量,提高了靈敏度。毛細管電泳(CE)是一種與HPLC互補的液相分離技術,其中膠束電動色譜(MEKC)是CE的一種分離模式。MEKC采用膠束電解質溶液,實現(xiàn)了毛細管電泳對電中性樣品的分離分析。與HPLC相比,CE分離時間短,樣品和試劑消耗量少,更容易實現(xiàn)自動化操作。

本工作的目的是發(fā)展膠束電動色譜結合柱上酶微反應的方法用于測定低分子量肝素(依諾肝素鈉)的抗凝血活性。該方法以毛細管進樣端作為微量的酶反應器,將依諾肝素鈉、ATⅢ、FXa和生色肽底物(CPS)溶液依次進樣,分別采用自由擴散、層流橫向擴散及電壓混合模式,實現(xiàn)反應物間的混合。待孵育反應結束后,直接進行電泳分離和檢測。為避免緩沖溶液中十二烷基磺酸鈉(SDS)對ATⅢ和FXa活性的影響,實驗采用了部分填充膠束電動色譜模式。采用柱上酶反應不僅降低了樣品和試劑的消耗量,還實現(xiàn)了檢測的自動化。MEKC可以將酶反應產(chǎn)生的對硝基苯胺(p-NA)與樣品中的其他物質分離,因此可以在對硝基苯胺的最大吸收波長(380 nm)下進行測定,提高了測試的靈敏度。為了保證方法的重復性和定量準確性,實驗使用呋喃妥英(NF)作為內標。通過方法的驗證,證明了該方法具有較好的重復性和準確度。

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

磷酸氫二鈉·12H2O、氯化鈉、二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na·2H2O)、聚乙二醇6000 (PEG 6000)、SDS和氫氧化鈉(NaOH)均購自阿拉丁有限公司(上海)。鹽酸購自上海第四試劑廠(江蘇昆山)。依諾肝素鈉標準品購自美國藥典(USP); CPS(序列:CH3OCO-D-Val-Gly-Arg-para nitroaniline)、p-NA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲亞砜(DMSO)和NF均購自Sigma-Aldrich公司(美國)。ATⅢ(1×25 IU)和FXa(10×71 nkat)購自Chromogenix公司(意大利)。甲醇(HPLC級)購自Fisher Scientific公司(美國)。兩個批次的LMWHs(依諾肝素鈉)分別來源于賽諾菲-安萬特(Sanofi Aventis公司,法國)和杭州九源基因工程有限公司。

1.2 溶液的配制

分別配制2 mol/L Tris、2 mol/L NaCl、0.5 mol/L磷酸氫二鈉、0.5 mol/L SDS、1 mol/L HCl、0.5 mol/L EDTA和10%(v/v)PEG 6000儲備液。

使用上述儲備液分別配備分離緩沖液(40 mmol/L磷酸鹽緩沖液,其中含有25～45 mmol/L SDS, pH 7.4)、反應緩沖液(50 mmol/L Tris-H3PO4,含有150 mmol/L NaCl, pH 7.4)和用于產(chǎn)生橫向擴散的Tris PEG 6000緩沖液(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和0.1%PEG 6000, pH 7.4)。以上溶液均使用1 mol/L H3PO4調節(jié)pH值。

使用水-乙醇(90∶10, v/v)配制5 mmol/L對硝基苯胺儲備液,使用DMSO-水(10∶90, v/v)配制0.1 mol/L呋喃妥英儲備液。對硝基苯胺和呋喃妥英工作液在使用前由儲備液稀釋而得?？鼓窤TⅢ溶液溶解為5.0 IU/mL的儲備液,然后使用含有PEG 6000的Tris緩沖液稀釋為1.0 IU/mL的工作液。配置7.1 nkat/mL的凝血因子FXa溶液作為工作液。首先用水配制3 mmol/L的生色肽底物儲備液,使用前用pH 7.4反應緩沖液稀釋得到0.5 mmol/L的生色肽底物工作液。用水溶液配制1.0 IU/mL的依諾肝素鈉標準溶液(S),然后按0.78的劑間比,用pH 7.4反應緩沖液分別稀釋至0.087、0.111、0.143和0.183 IU/mL，分別用S1～S4表示。首先對供試品預估一個效價,按照標準品配制的方法,配制含量為0.087、0.111、0.143、0.183 IU/mL的依諾肝素鈉工作溶液，分別用T1～T4表示。所有溶液均由超純水配制(Millipore超純水系統(tǒng),Millipore公司,USA),配制好的溶液置于4 ℃冰箱儲存,所有緩沖溶液在使用前用0.45 μm濾膜過濾。

1.3 CE分離條件

所有的CE實驗均在配有UV檢測器的P/ACE MDQ CE系統(tǒng)(Beckman Coulter公司,美國)上進行。熔融石英毛細管柱:50 μm i.d.、365 μm o.d.、總柱長30 cm、有效長度19.5 cm,購自邯鄲鑫諾光纖色譜。新的毛細管柱用0.1 mol/L NaOH溶液活化30 min,再用超純水和電泳緩沖液分別沖洗2 min。每一次分析前用0.1 mol/L NaOH、超純水和電泳緩沖液分別沖洗2 min。毛細管柱溫為25 ℃,分離電壓為15 kV。除非另外說明,UV檢測波長均為380 nm。

圖 1 反應物在毛細管內的層流橫向擴散混合示意圖Fig. 1 Schematic presentation for mixing reactants inside the capillary by transverse diffusion of laminar flow a. two reactants are injected; b. apply a short-time injection with high pressure; c. let stand to mix the two reactants completely.

柱上酶反應進樣步驟如下:(1)依次將依諾肝素鈉待測溶液和ATⅢ溶液以壓力140 Pa進樣3 s,靜置1 min使兩種溶液通過自由擴散混合;(2)隨后以壓力140 Pa導入FXa溶液3 s,在200 Pa壓力下進樣含有PEG 6000的Tris緩沖液(pH 7.4)3 s,使FXa溶液以圖1所示的層流橫向擴散的方式與依諾肝素鈉和ATⅢ復合物混合,靜置1 min; (3)將CPS溶液以壓力140 Pa進樣15 s后,施加3 kV電壓0.3 min,使FXa與ATⅢ進一步混合,靜置4 min; (4)最后,在優(yōu)化好的條件下分離檢測,記錄對硝基苯胺與內標NF的峰面積。值得注意的是,需要在方法中設定進樣程序,使得每次進樣后將毛細管柱進樣端浸入水中洗去黏附的試劑,以預防各個試劑間的交叉污染。

2 結果與討論

2.1 MEKC方法的建立和優(yōu)化

在測定低分子量肝素抗凝血活性的方法中,將柱上酶反應與MEKC分離檢測集成為一體。測定依諾肝素鈉抗凝血活性的柱上酶反應方法是將毛細管柱端作為酶微反應器,依次導入依諾肝素鈉、ATⅢ、FXa和CPS溶液,在柱內實現(xiàn)混合、反應、分離和檢測一體化,最大限度地實現(xiàn)檢測的自動化。由于生成的對硝基苯胺為電中性,只能通過MEKC進行分離測定。我們對MEKC方法進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)采用30 cm總長的石英毛細管、含20 mmol/L SDS的40 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)、分離電壓15 kV、柱溫20 ℃時,能夠實現(xiàn)對硝基苯胺和內標的最佳分離。

2.2 在線酶反應進樣順序、混合方式和反應條件的選擇

由于分離緩沖液中的SDS會影響酶的活性,實驗在進樣前后均進一段反應緩沖液(200 Pa×3 s)隔離酶反應器。為避免試劑的交叉污染,在進樣程序中設定毛細管在每進一個試劑后在反應緩沖液瓶中浸洗,洗掉毛細管柱和電極上的試劑。在肝素類藥物抗凝血活性測試的實驗中,試劑的穩(wěn)定性對最終測試結果的準確性影響很大。因此,我們首先考察了FXa在測試條件下的穩(wěn)定性。將FXa從4 ℃冰箱中取出后,室溫下放置20 min,然后以140 Pa的壓力依次導入FXa 3 s和CPS 15 s,自由擴散混合,靜置4 min后電泳分離。實驗發(fā)現(xiàn),FXa在室溫下放置200 min,活性基本保持不變,200 min之后,FXa活性衰減較為明顯。但是在室溫下,ATⅢ的活性會發(fā)生明顯的衰減,因此在測試依諾肝素鈉抗凝血活性時每分析8個樣品更換一次FXa,但是ATⅢ溶液需要每次更換。兩種生化試劑在每次從冰箱取出時,均在室溫下放置20 min以恢復酶的活性。

樣品和試劑在毛細管柱端的混合程度直接影響酶與底物的混合效果和反應,從而對測定結果產(chǎn)生影響。毛細管中一般不存在湍流,因此混合的過程主要通過電泳淌度差和分子擴散兩種方式[11,12]。當以較低壓力進樣時,反應物區(qū)帶界面能夠保持較平整,反應物間的混合是通過分子的縱向擴散實現(xiàn)的。擴散是所有分子的基本性質,因此可適用于具有相同電泳淌度的反應物的混合?？v向擴散混合不會造成反應物的區(qū)帶發(fā)生大的移動,因此混合后的反應物仍然在毛細管柱頭保持較小的區(qū)帶,從而利于高的分離柱效。但是使用這種混合方式不適于多種反應物參與的反應。橫向擴散方式發(fā)生在混合界面間有橫向接觸面的反應物區(qū)帶間[12]。橫向界面只有在短時間內施加高壓力進樣時,由于產(chǎn)生了拋物線形的流速輪廓,使進樣后的各個反應物在橫向發(fā)生接觸。然而,為了保證樣品區(qū)帶處于層流狀態(tài),所使用的壓力也不能太高。圖1所示即為利用層流橫向擴散的方法實現(xiàn)反應物的混合。在這種方法中不同反應物的溶液依次以較高壓力、較短時間進樣,使所有反應物之間均有較大的橫向接觸面積,從而通過擴散達到混合的目的。

依諾肝素鈉與ATⅢ的進樣體積均相對較小,這兩種試劑進樣后靜置1 min,即采用自由擴散混合并反應;為使依諾肝素-ATⅢ復合物與FXa混合均勻,使用層流橫向擴散混合方式, FXa的等電點(pI 5.68)比CPS(pI 6.74)小,因此在反應條件下(pH 7.4), FXa帶更多負電荷,為了使游離的FXa與CPS混合,實驗在這一步采用電壓混合。固定混合電壓為3 kV,實驗同時考察了混合時間對混合情況的影響。游離的FXa與CPS混合越充分,產(chǎn)生的對硝基苯胺也就越多,根據(jù)圖2可以看出,當混合時間為0.3 min時,產(chǎn)生的對硝基苯胺最多,因此最終確定電壓混合條件為3 kV、0.3 min。

圖 2 FXa與CPS混合時間對p-NA反應產(chǎn)率的影響Fig. 2 Effect of the mixing time of anti-factor Xa (FXa) and chromogenic peptide substrate (CPS) on the reaction yields of p-nitroaniline (p-NA)

2.3 方法驗證

在優(yōu)化的電泳條件下,考察了方法的重復性。對硝基苯胺的遷移時間以及經(jīng)內標校準的峰面積在日內和日間的重復性列于表1?？梢钥闯?經(jīng)過內標校準后對硝基苯胺峰面積的重復性得到明顯改善。隨后我們對線性范圍進行了考察,如圖3所示,在0.025～1.0 mmol/L的對硝基苯胺濃度范圍內,線性關系良好。測得方法的檢出限(LOD)(3倍信噪比)為0.025 mmol/L,定量限(LOQ)(10倍信噪比)為0.075 mmol/L。如圖4所示,在MEKC的分離條件下,CPS、FXa、ATⅢ和依諾肝素鈉均不會在4 min內出峰,因此不干擾對硝基苯胺的測定。

表 1 對硝基苯胺遷移時間、峰面積以及峰面積比的 日內和日間精密度

圖 3 對硝基苯胺的標準曲線(n=3)Fig. 3 Standard curve of p-NA (n=3) Concentrations of p-NA: 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mmol/L; concentration of nitrofurantoin (NF): 0.1 mmol/L; Injection: 140 Pa×10 s. y: peak area ratios of p-NA to NF; x: concentration, mmol/L; R2: correlation coefficient.

圖 4 依諾肝素鈉標準溶液抗FXa活性測試電泳圖Fig. 4 Electropherograms for the determination of anti-FXa activity of enoxaparin sodium (E) Contents of E: S1, 0.087; S2, 0.111; S3, 0.143; S4, 0.183 IU/mL.

2.4 LMWHs抗FXa活性的測試

由于FXa溶液是過量的,依諾肝素介導的ATⅢ對凝血因子活性的抑制作用可以通過測定產(chǎn)生的對硝基苯胺含量獲得,這樣也就獲得了依諾肝素的抗凝血活性。對硝基苯胺是中性分子,實驗采用MEKC分離模式。為了保證定量的準確性及良好的方法重復性,采用NF作為內標。在常用的生色肽底物分光光度法中,為了避免發(fā)色肽底物和樣品基質對硝基苯胺檢測的影響，通常選擇檢測波長405 nm。由于這個波長不是對硝基苯胺的最大吸收波長，因此分光光度法的檢測靈敏度較低。我們的方法由于能夠將對硝基苯胺與酶反應液中其他成分分開，可以在其最大吸收波長380 nm處檢測，以獲得最佳的檢測靈敏度。

圖 5 依諾肝素鈉峰面積比-濃度對數(shù)值線性校準曲線Fig. 5 Calibration curve of E constructed by peak area ratio vs log concentration value

以依諾肝素鈉標準品或供試品溶液含量的對數(shù)值為橫坐標,對硝基苯胺與NF的峰面積比為縱坐標分別作線性回歸曲線,并按照生物鑒定統(tǒng)計法測量反應平行線測定法(4×4法)計算效價和實驗誤差。使用本文方法測試了兩批分別來源于賽諾菲和杭州九源公司的依諾肝素鈉藥物。將所得數(shù)據(jù)以標準品(或供試品)溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標,以相應的校正峰面積為縱坐標分別做線性回歸,結果見圖5。所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)生物鑒定統(tǒng)計法(4×4法)進行統(tǒng)計分析,計算得到兩個批次樣品的效價如表2所示,平均可信限率(FL)小于5%,均通過可靠性檢測。試品間、劑間回歸顯著,偏離平行、二次曲線、反向二次曲、區(qū)組間不顯著(見附表1和附表2,詳見http://www.chrom-China.com)?；贛EKC法測得的兩批依諾肝素的效價與它們的標示效價一致(標示效價為廠家標注)。

表 2 兩個批次樣品的效價結果Table 2 Potency results of two batches of samplesSampleAssumed potency/(IU/mL)Determined potency/(IU/mL)SM/%FL/%E-110000 120280.904.9E-212000132820.734.0 SM: standard error; FL: fiducial limit.

3 結論

本文發(fā)展了MEKC結合柱上酶反應的方法用于測定低分子量肝素的抗凝血活性,實現(xiàn)了進樣、混合、反應及分離檢測一體化,顯著提高的檢測的實驗精度和自動化程度,同時也降低了樣品和試劑的消耗量。方法可用于低分子量肝素生產(chǎn)和臨床應用時測定抗凝血活性。